Искусственный шелк паука производство в лабораторных масштабах
Summary
Несмотря на выдающиеся механические и биохимические свойства шелка пауков, эти материалы не могут быть собраны в большом количестве с помощью обычных средств. Здесь мы опишем эффективную стратегию вращаться искусственного шелка паука волокна, которое является важным процессом для изучения следователями паук производство шелка и их использование в качестве следующего поколения биоматериалов.
Abstract
Как общество прогрессирует и ресурсов становится все меньше, она становится все более важным развивать новые технологии, инженер следующего поколения биоматериалов с высокими эксплуатационными свойствами. Развитие этих новых конструкционных материалов должно быть быстрым, экономичным и включают обработку методик и продуктов, которые являются экологически чистыми и устойчивыми. Пауки крутиться множество различных типов волокон с различными механическими свойствами, предлагая богатый источник следующего поколения конструкционных материалов для биомимикрия что соперник лучших искусственных и натуральных материалов. Так как набор большого количества натурального шелка пауков нецелесообразно, производство синтетического шелка имеет возможность предоставить ученым доступ к неограниченным запасом темы. Поэтому, если вращающийся процесс может быть упрощен и усовершенствован, искусственных волокон паука есть возможность использования для широкого спектра применений, начиная от бронежилета, хирургические шовныес, канаты и тросы, шины, струны для музыкальных инструментов, а также композиционных материалов для авиационной и космической техники. В целях ускорения процесса производства синтетического шелка и для получения волокна, которые отображают низкой дисперсией по своим свойствам материал из спин спина, мы разработали мокрого прядения протокол, который объединяет экспрессия рекомбинантных белков шелка пауков в бактерии, очистки и концентрации белков , а затем методом экструзии волокна и механического после лечения спина. Это первое визуальное представление, что показывает, шаг за шагом процесс спина и анализ искусственных волокон шелка в лабораторном масштабе. Он также содержит подробную информацию, чтобы свести к минимуму введением вариабельность волокна нити из одного вращающегося допинг. В совокупности эти методы будут стимулировать процесс искусственного шелка, что приводит к более высоким качеством волокна, которые превосходят натуральный шелк паука.
Introduction
Паук шелк обладает экстраординарными механические свойства, что из выполняет несколько искусственных материалов, в том числе из высокопрочной стали, кевлара и нейлона. 1 Пауки крутиться как минимум 6-7 различных типов волокон, которые отображают разнообразные механические свойства, каждый из которых предназначен с разным количеством прочность и растяжимость для выполнения определенных биологических задач. 2 исследования ученые быстро стремится к использованию шелка паука в качестве следующего поколения биоматериалов, потому что их выдающиеся механические свойства, их биосовместимости, и их нетоксичными и зелено-материальной природы. 3,4 Из-за людоедских и ядовитых паукообразных природы, сбор пауков шелка через сельское хозяйство не является практической стратегии для удовлетворения потребностей необходимых для промышленного производства масштабе. Таким образом, ученые обратились к производству рекомбинантных белков шелка в трансгенных организмов в сочетании с в пробирке прядение синтетических волокон изсебе очищенного белка. 5-8 Выражение полнометражный рекомбинантных белков паутины было технически сложно, учитывая внутренние свойства их последовательностей генов, в том числе их очень повторяющийся характер и физическую длину (> 15 кб), GC-богатым содержанием и предвзятым аланин и глицин кодонов. 9-11 На сегодняшний день большинство лабораторий были направлены на выражение усеченной формы основных ampullate протеины шелка MaSp1 или частичном использовании MaSp2 кДНК или синтетических генов. 12-15 прядильно синтетического шелка пауков является сложным процессом, требующим мастерство и знания в различных научных дисциплин, и в тонкостях процесса прядения, не были полностью открыты широкой общественности с помощью видео-представление. На самом деле, лишь немногие из лабораторий по всему миру есть опыт, чтобы выразить кДНК шелка паука, очистить протеины шелка, спина синтетических волокон и выполнять после спин-дро, и, наконец, проверить свои свойства биоматериалов. 8,16,17 различные подходы для прядения синтетических волокон охватили влажные и сухие прядильных а также методы электропрядения 16,18,19 Все процедуры имеют одну цель общего -. Разработке протокола, который производит синтетический шелк пауков с механическими свойствами, которые могут соперничать нити из натуральных для крупных коммерческих производственных процессов.
Здесь мы опишем процедуру создания искусственного шелк паука в лабораторном масштабе с использованием мокрого прядения методологии. По сравнению с другими методами прядильных, мокрого прядения произвел наиболее последовательные результаты для волоконно-анализа. Опишем эту процедуру, начиная с выражением рекомбинантных белков шелка в бактерии, а затем их очистки, а затем описать белкового препарата шаги для прядения, в том числе после ничьей спина методологии применительно к "как нити" волокна, что дает нити свойства материалов, которые подходят к качеству природных шелк паука. Наши методичесу предназначен для точного моделирования естественного процесса прядения шелка и волокон в значительной степени опирается на наш опыт в архитектуре и функциях шелковых желез с шаром и початков плетение пауков. 20-22 Кроме того, мы заключаем с необходимыми шаги для определения физических свойств синтетических волокон с использованием тензометр построить напряженно-деформированного кривые, которые позволяют исследователям рассчитать предел прочности, предельной деформации и прочность волокна. Наконец, но существенное значение, спиннинг, подкачку и рисование аппаратов может быть домашний построены с использованием коммерчески доступных частей, вместо того чтобы покупать сложную и дорогостоящую нестандартного оборудования.
Protocol
Discussion
Синтетические волокна кружилась от этой методики механически того же порядка величины по сравнению с натуральными волокнами. Уменьшая количество человеческих ошибок по механизации буферизации и после процессов спин ничья, разница между экспериментальными образцами более контролир…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NSF RUI Гранты MCB-0950372 и DMR-1105310 озаглавленной «Молекулярная характеристика паука Черная вдова шелка и механического поведения паука шелка клея", соответственно.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. . Biology of spiders. , (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. . Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C., Cuppoletti, J. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. 2, 303-324 (2011).
