Lettere Drug Discovery: En automatiseret High-indhold Betændelse Assay i zebrafisk

Summary

Her beskriver vi en ny high-indhold kemisk induceret inflammation analyse med henblik på identifikation af immun-modulerende Bio Actives. Vi har med succes kombineret automatiseret mikroskopi med brugerdefinerede udviklet software scripts gør det muligt automatisk kvantificering af den inflammatoriske respons samt yderligere behandling af data, analyse, minedrift, og opbevaring.

Abstract

Zebrafisk larver er særligt egnede til hele dyret lille molekyle skærme ^1,2 på grund af deres lille størrelse og relativt lette manipulation og observation, samt den kendsgerning, at forbindelserne kan simpelthen tilsættes til badevand og let absorberes, når det administreres i en <1% DMSO-opløsning. På grund af den optiske klarhed af zebrafisk larver og tilgængeligheden af transgene linier, der udtrykker fluorescerende proteiner i leukocytter, zebrafisk giver enestående fordel overvåge en akut inflammatorisk respons in vivo. Følgelig har anvendelse af zebrafisk for højt indhold småmolekylære skærme henblik på identifikation af immun-modulerende forbindelser med højt gennemløb blevet foreslået ^3-6, hvilket tyder på inflammation induktion scenarier f.eks lokaliserede nicks i fin væv laser beskadigelse rettet mod blommen overflade embryoner ⁷ eller Tailfin amputation ^3,5,6. Den største ulempe ved disse metoder imidlertid varkravet om manuelt larver manipulation for at inducere sårdannelse, hvilket forhindrer high-throughput screening. Introduktion af kemisk induceret inflammation (Chin) analysen ⁸ elimineret disse hindringer. Idet såring påføres kemisk antallet af embryoer, som kan behandles samtidigt, er praktisk talt ubegrænset. Midlertidig behandling af zebrafisk larver med kobbersulfat selektivt inducerer celledød i hårceller i den laterale linie, og resulterer i hurtig granulocyt rekruttering til sårede neuromasts. Den inflammatoriske reaktion kan følges i sand tid ved anvendelse af forbindelse transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 ^6,9 zebrafisk larver, der udtrykker et grønt fluorescerende protein i neuromast celler, såvel som et rødt fluorescerende protein mærkning granulocytter.

Med henblik på at udtænke en screening strategi, der ville tillade både høj-indhold og høj-throughput analyser introducerede vi robotter Væskehåndtering og kombineret automatiseret MICRoscopy med en brugerdefineret udviklet software script. Dette script gør det muligt automatisk kvantificering af den inflammatoriske reaktion ved at score procent arealet af røde fluorescerende leukocytter i en empirisk afgrænset område omkring sårede grønt fluorescerende neuromasts. Derudover har vi automatiseret databehandling, håndtering, visualisering og lagring alle baseret på brugerdefinerede udviklet MATLAB og Python scripts.

I korthed, introducerer vi en automatiseret HC / HT skærm, der giver mulighed for afprøvning af kemiske forbindelser for deres effekt på initiering, progression eller opløsning af et granulocytisk inflammatorisk respons. Denne protokol tjener et godt udgangspunkt for mere dybdegående analyser af narkotika mekanismer og veje, der er involveret i orkestreringen af ​​en medfødt immunrespons. I fremtiden kan det hjælpe med at identificere uacceptable toksiske eller off-target effekter ved de tidligere faser af lægemiddelforskning og dermed reducere proceduremæssige risici og omkostninger for udvikling af lægemidler.

Protocol

1. Håndtering af dyr For Chin analysen brugen 3 dpf larver som følge af koncernens parringer mellem homozygot dobbelt transgene cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 og AB (vildtype) fisk. Indsamle embryoner naturlig gydning og løfte dem ved 29 ° C i E3-medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCI, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4, og 0,1% methylenblåt, ækvilibreret til pH 7,0) i petriskåle. Det er vigtigt at opretholde en densitet af embryoer, der ikke overstiger 50-70 per plade. 2. Larve Sortering Se alle larver under en fluorescens stereoskop for fluorescerende reporter udtryk, spontan inflammation og passende aldersbetingede udvikling. 3. Screening Medium Forberedelse (altid udarbejde frisk) Forberede E3 medium uden methylenblåt suppleret med DMSO (1% endelig) og MS222 (0,05 g / l). 4. CuSO4Forberedelse (Altid lav en frisk) Første afvejes CuSO4 (Mr = 159,6 g / mol) og forberede en 20 mM stamopløsning i dH 2 O. Fremstille 120 uM CuSO4 arbejdsopløsning (fra 20 mM stamopløsning) i E3/DMSO (1%) / MS-222. Beskytte CuSO4-opløsning fra lys. 5. 384-brøndplade Fremstilling (Greiner 384 brønds mikroplade) Præ-tilsættes 20 ul E3/DMSO (1%) / MS-222 i hver brønd med en omvendt pipette. En forøget pipettespids boringen er nødvendig for at håndtere de embryoner forsigtigt uden at påføre nogen sårdannelse og dette gøres ved at skære spidsen af ​​en 2 mm boring. Overførsel enkelt larve i 74 ul medium til hver brønd (84 pi for ubehandlet kontrol). Hvis det er nødvendigt, bruger orientere larver i en lateral position inden for godt en fleksibel Eppendorf Microloader pipettespidsen (Eppendorf, 5242 956,003). Udføre alle følgende væskehåndteringssystemer trin med en robot væskehåndtering arbejdsstation for at sikre samtidig behandling af alle larver. 6. Drug Behandling Blande forbindelser i lægemiddelstamopløsning pladen 5 gange ved pipettering op og ned. Tilsættes 16 ul 7,5 x lægemiddelstamopløsning plade til hver brønd og bland 5 gange. Juster tip position inden brønde til at forebygge skader af larver og dispensere mediet på 10 ul / s. Blandes medium i brøndene 4 gange for at sikre homogen fordeling af lægemidlet inden i brønden. 7. Inkubation Inkuber screening plade i 1 time ved 29 ° C dækket med aluminiumfolie for at beskytte forbindelserne såvel som CuSO4 mod lys. 8. Kemisk Anskydning Tilsæt 10 gl 120 uM CuSO4 brugsopløsning til hver brønd med undtagelse af at negative kontroller, bland 4 gange og inkuberes igen i 1 time ved 29 ° C. 9. Vask Fjern og udveksle 80 gl mig dium fra hver brønd to gange (i 20 pi trin) for at fjerne forbindelser, og CuSO4. 10. Billede Acquisition Start billede opkøbet på en omvendt automatiseret mikroskop (dvs.: Olympus scan ^ R) 90 minutter efter den første kobber behandling. Indstil Initial z-plan, således at neuromasts fra højre og venstre posteriore laterale linie er synlige. Billede hver brønd en gang i timen i kanalerne lysfelt, ved hjælp af Cy3 og GFP i 4 brændpunktsflader (50 um afstand) et 4x objektiv (NA = 0,13). Yderligere oplysninger om billede og databehandling er tilgængelige efter anmodning. 11. Image Processing 1. Data sortering RAW-billeder behandles med vores kunder LabVIEW software script. Den første operation i billedet behandlingen rørledningen sortering af rå billeder fra mikroskopet genereret data mappe ved kanalen, godt og tids-punkt oplysninger. ove_step "> 2. Udvidet fokus Efterfølgende software skaber udvides fokus billeder fra 4 brændpunktsflader for hver af kanalerne. 3. RGB-overlay I et sidste trin de udvidede fokus billederne fra de 3 kanaler er samlet at resultere i en endelig RGB-overlay billede. 4. Automatiseret neuromast afsløring En mønstergenkendelse værktøj (LabView Rapid IA prototyping værktøj) identificerer neuromasts inden for de RGB-overlay billeder og skaber en empirisk afgrænset område af interesse omkring neuromasts. 5. Kvantificering Inden for empirisk definerede område af interesse omkring tilskadekomne neuromasts rødt fluorescerende leukocytter (afspejlet som røde pixels) scorede resulterer i en primær udlæsning af p ercent en rea o ccupied af L eukocytes (PAOL). I gennemsnit 95,27 ± 2,11% (FDA1) og 95,12 ±1,56% (FDA2) af brønde (larver) er blevet opdaget ordentligt og har efterfølgende været udsat for yderligere behandling af data. Den rå data output (PAOL for hver detekteret neuromast) gemmes i en txt-fil og tjener som datainput for de MATLAB scripts, der behandler de rå data yderligere. 12. Databehandling 1. Imaps Vurdering af den enkelte eksperimenter ved grafisk visualisering af den rå data output PAOL i en farvekode kunne realiseres med såkaldte betændelse kort (imaps) (Figur 2). Bright green afspejler en høj initial inflammatorisk indeks, sort angiver ingen betændelse. Denne hurtige overblik giver mulighed for hurtig identifikation af mislykkede eksperimenter, som derefter kan udelukkes fra yderligere dataanalyser. 2. Midling af kontrol Hver eksperimenterende plade indeholder 320 stoffer, der afspejler enenkelt datapunkt pr forbindelse og tids-punkt samt 32 positive og negative kontroller. Den 32-kontrol gentagelser er gennemsnitstal og standardafvigelse beregnes. For de kontroller kun datapunkter inden for 2 standardafvigelser er inkluderet. 3. Normalisering Normalisering udføres ved regneark analyse. Den gennemsnitlige værdi af DMSO, som er den negative kontrol, er sat til 0, og den højeste gennemsnitlige PAOL for kobber er indstillet til 1, så at den maksimale forskel mellem den positive og negative kontrol er indstillet til en. Hver stoffets PAOL er lineært interpoleret eller ekstrapoleret til de respektive kontrol med den eksperimentelle pladen. 4. Endelig udlæsning: inflammatorisk index Efter tilstrækkelig replikate eksperimenter (dvs. 15) er blevet udført, er normaliserede rå data fra gentagne eksperimenter gennemsnit, hvilket resulterer i en endelig udlæsning – inflammatoriskeindeks. Den oprindelige inflammatoriske indekset for den kobber kontrol starter ved 100% for tids-punkt nul, og korrelerer til billede erhvervelse starttidspunktet (90 minutter efter første kobber behandling). 5. Monoton eksponentiel regression montering På grund af betændelse opløsning i gang vi udfører en monoton eksponentiel lineær regression montering mod den indledende betændelse ved hjælp af – Et 0 er et mål for den første reaktion ved t = 0, er en 1 relateret til hældningen af størrelsen over tid. 6. 2-D-funktionen rum plot (fig. 4) At generere funktionen rum, er en ikke-lineær regression, samt en klynge-analyse opdeler funktionen rummet i karakteristiske regioner, således at automatiseret identifikation af interessante kandidater fra forskellige immun-modulerende grupper (anti-inflammatORY, anti-opløsning, pro-inflammatoriske, pro-opløsning). Alle forbindelser vises i 2-D plot baseret på de parametre, en 0 og 1. 13. Datahåndtering og opbevaring Vores data håndtering rutiner oprette websider til at visualisere og udgør sådanne narkotika skærme giver et hurtigt overblik over billedet og databehandling trin resultater, samt en detaljeret oversigt efter anmodning fra brugeren 10. Bløde links til andre relevante heterogene biologiske og kemiske databaser er integreret samt at give en værdifuld ressource for sammenlignende og nye undersøgelser 11. Med disse rutiner, er korrekte datastandarder og metainformation sat til langtidsopbevaring af disse data. 14. Repræsentative resultater I en pilot skærm analyserede vi et bibliotek bestående af 640 FDA godkendt kendte bioaktive stoffer for effekter på initiering, progression eller opløsning af et granulocytic inflammatorisk respons. Baseret på de observerede virkninger, vi er klassificeret 4 typer immun modulerende fænotyper, som kan være tegn på forskellige former for foranstaltninger: anti-inflammatoriske (1), anti-beslutning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-opløsning (4) , som kan beskrives med parametrene en 0 og 1, der opstår fra en monoton ikke-lineær regression fitting (e ao ​​+ ALX -) mod den første inflammation. En 0 repræsenterer størrelsen af det inflammatoriske respons der en en karakteriserer kurvens hældning og således beskriver inflammation opløsning. Visning af alle forbindelser i en 2-D-funktionen rum plot (en 1 vs en 0) tillader automatiseret identifikation af ramt kandidater fra forskellige immun modulerende grupper (figur 3). 45 ud af 640 forbindelser udøvede signifikant anti-inflammatorisk virkning ved at reducere det oprindelige inflammatoriske indekset til 50% eller mindre. Inden this kategori vi har fundet 6 forbindelser tilhører den farmakologiske klasse af non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), der bekræftede gyldigheden af ​​vores tilgang. Imidlertid NSAID rangeret ikke blandt de mest potente anti-inflammatoriske lægemidler. Bortset fra de NSAID'er har vi fundet adskillige yderligere farmakologiske lægemiddelklasser såsom for eksempel Angiotensin-antagonister (ARB'er), antibiotika og protonpumpe-inhibitorer. 7 forbindelser opfylder empirisk bestemt tærskel kriterier for potentielle pro-opløsning lægemidler. 18 lægemidler udøvede en pro-inflammatorisk virkning, hvilket resulterer i overdreven leukocytrekruttering til sårede neuromasts forhold til de positive kontroller. Kun 2 forbindelser forhindret rettidig bilæggelse af den inflammatoriske respons. Den antiinflammatoriske virkning af adskillige hit kandidater (eksempelvise kandidater fra ovennævnte farmakologiske lægemiddelklasser) fra pilot skærmen Could bekræftes på en dosis-afhængig måde i efterfølgende sekundære Chin assays (data ikke vist). Testes igen 4 potentielle pro-opløsning lægemidler ikke bekræfte den angivne virkningsmekanisme, som udøves i den primære skærm. 2 af de lægemidler havde en svag anti-inflammatoriske potentiale ved højere koncentrationer (20 uM). En tredje lægemiddel udviste marginal ikke dosisafhængig anti-inflammatorisk virkning ved lægemiddelkoncentrationer i området fra 5 til 20 uM. Den fjerde lægemiddel havde ingen virkning på den inflammatoriske reaktion ved de testede koncentrationer. Figur 1. Arbejdsgang af hagen assayet. Individuelle forbindelse transgen cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 larver (3 dpf) er manuelt fordelt i 384-brønds mikrotiterplader. Medikamenter tilsættes samtidigt til hver brønd med en Zephyr Compact Væskehåndtering Workstation. Assaypladerne inkuberes derefter i 1 time ved 29 ° C. Behandling med CuSO4 </sub> – Opløsning (10 uM slutkoncentration) i 1 time påfører den sårdannelsen og initierer en akut inflammatorisk respons. Endelig er kobber løsning og narkotika vaskes og automatiseret billede købet startes (90 minutter efter den første kobber behandling). Figur 2. . Oversigt over billedet af rå billeder Figuren viser rå billeder af 4 brændpunktsflader (Z = 0 – 3) ved afstande på 50 um i kanalerne Cy3 (venstre) og GFP (til højre), hhv. Pile (Z = 1,2) angiver eksemplariske neuromasts og pilespidser (Z = 1,2) peger på klynger leukocytter omkring neuromasts. Figur 3. Inflammation Maps (imaps) succes individuelle eksperimenter kan vurderes i imaps afspejler det inflammatoriske respons (rådata) i en farvekode:. Bright green afspejler en høj initial inflation mmatory respons; sort indikerer ingen betændelse imaps på tidspunkterne 0 (til venstre) og tid-punkt 5 (højre) viser tydeligt, om forsøget skal indgå i den videre databehandling.. Kobber kontroller (række 13 og 24) dukke op i forskellige nuancer af grønt, mens DMSO kontrol brønde (række 1 og 12) vises i mørkegrøn eller sort. På tids-punkt 5, er betændelse næsten løst i kobber kontrol, nu anført i mørke nuancer af grøn eller sort. Klik her for at se større figur . Figur 4. 2-D træk rum plot af 320 forbindelser med en FDA-godkendt bibliotek og deres respektive kontroller. Alle sammensatte brønde kan vises i en 2-D-funktionen plads plot baseret på de parametre en 0 og 1, som opstår fra en ikke-lineær regression montering (d/4203/4203eq1.jpg "alt =" Equation 1 "/>) mod den første betændelse. Denne funktion plads plot giver mulighed for automatiseret identifikation af interessante kandidater, der tilhører en af ​​de følgende 4 immun-modulerende kategorier, som kan være vejledende for de lægemidler "virkningsmekanisme:. anti-inflammatorisk (1), anti-beslutning (2), pro-inflammatorisk (3) og pro-opløsning (4) Klik her for at se større figur .

Discussion

<p class="jove_content"> Her udgør en fuldt automatiseret high-throughput screening strategi muliggør identifikation af immun-modulerende forbindelser i et helt dyr forbindelse. Således at overvågning af en akut inflammatorisk respons<em> In vivo</em> Og i realtid.</p><p class="jove_content"> Vi tilbyder en protokol til at anvende zebrafisk som en værdifuld model organisme for drug discovery eller narkotika nyorientering indsats, da narkotika virkninger på leukocytrekruttering til sår kan studeres med relativ lethed i forbindelse med en fuldt funktionel medfødte immunsystem. Den unikke fordel ved vores tilgang er, at kemiske såret gør manuel larver manipulation forældet, hvilket tillader automatisering og screening i en high-throughput format.</p><p class="jove_content"> Derudover kan bivirkninger eller toksiske stofvirkninger samt stærke off-target effekter let vurderes med den foreslåede set-up. FDA godkendte Biblioteket imidlertid ikke indeholder giftige stoffer i de givne screening koncentrationer. Alligevel foreslår vi, for tilsyneladende giftige stoffer til at sammenligne de tilgængelige datasæt (f.eks immun modulerende fænotype, medikamentkoncentrationen) mellem medlemmer af samme farmakologiske stof klasse til stede i den testede biblioteket. Giftige medlemmer af et stof familie, der ellers udøver en lovende immun modulerende fænotype, kan testes igen ved lavere koncentrationer, hvis det bliver nødvendigt.</p><p class="jove_content"> Vi har påvist muligheden for kategorisering lægemidler automatisk i henhold til deres udøves immun-modulerende virkning. Lægemidler, der tilhører klassen af ​​anti-inflammatoriske forbindelser kan valideres i uafhængige eksperimenter, er de fleste af de forbindelser udøver deres virkning på en dosis-afhængig måde. Fire forbindelser identificeret som potentielle pro-opløsning lægemidler kunne hidtil ikke bekræftes som sådan. Det viser også, at denne særlige immun-modulerende gruppe er vanskeligt at beskrive, eftersom ingen stoffer alene påvirker opløsning er hidtil blevet beskrevet i litteraturen. Imidlertid 3 af de 4 Efterproevet lægemidler viste en anti-inflammatorisk tendens ved højere molære koncentrationer. Optimering af empirisk definerede tærskelkriterierne skal bidrage til at reducere antallet af falsk-positive.</p><p class="jove_content"> Endvidere præsenterede teknik giver mulighed for at blive anvendt til identifikation af mutationer i gener, der påvirker leukocyt vandrende adfærd⁸.</p><p class="jove_content"> Afsluttende, den foreslåede metode kan lette og fremskynde drug discovery eller narkotika nyorientering indsats ved at give potentielle nye ledende strukturer med let tilgængelige oplysninger om narkotika tolerance, toksicitet, dosering samt mulige off-target effekter. Derfor tjener som en enkel, omkostnings-og tidsbesparende strategi tidlige stadier af udviklingen af ​​lægemidler.</p

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Dimethyl sulphoxide	Carl Roth GmbH & Co KG	A994.2
Copper(II) sulphate anhydrous	Carl Roth GmbH & Co KG	PO23.1
FDA approved drug library	Enzo Life Sciences	BML-2841-0100
384 microwell plate Non-binding, μClear	Greiner	781906	black
Olympus scan^R	Olympus
Zephyr Compact Liquid Handling Workstation	Caliper