Knoglemarvstransplantation tilvejebringer en måde at ændre genotype af knoglemarv-afledte celler. Hvis genet af interesse udtrykkes i både knoglemarvsafledte celler og ikke-knoglemarvsafledte celler, kan knoglemarvstransplantation ændre knoglemarv afledte celler til en anden genotype uden at ændre den ikke-knoglemarvsafledte celler genotype.
For at forstå den rolle, et gen i udviklingen af colitis, sammenlignede vi svarene fra vildtype-mus og gen-af-interesse deficiente knockout-mus til colitis. Hvis genet af interesse udtrykkes i både knoglemarvsafledte celler og ikke-knoglemarvsafledte celler af værten, men det er muligt at skelne rollen af et gen af interesse i knoglemarv afledte celler og ikke-knoglemarv afledte celler ved knoglemarvstransplantation teknik. For at ændre knoglemarvsafledte celler genotype af mus, blev den oprindelige knoglemarv fra recipientmus ødelagt ved bestråling og derefter erstattes af nye donorknoglemarv af forskellige genotype. Når vildtype-mus donorknoglemarv blev transplanteret til knockout-mus, kunne vi generere knockout-mus med vildtype-genekspression i knoglemarv afledte celler. Alternativt blev da knockout mus donor knoglemarv transplanteres til vildtype-recipientmus, vildtype-mus uden gen af interesse udtrykkerfra knoglemarv afledte celler blev fremstillet. Imidlertid kan knoglemarvstransplantation ikke være 100% komplet. Derfor har vi udnyttet differentieringsklynge-(CD)-molekyler (CD45.1 og CD45.2) som markører for donor-og recipientceller at spore andelen af donorknoglemarv afledte celler i recipientmus og succes af knoglemarvstransplantation. Vildtypemus med CD45.1 genotypen og knockout mus med CD45.2 genotype blev anvendt. Efter bestråling af recipientmus, var donor knoglemarvceller hos forskellige genotyper infuseres ind i recipientmus. Når den nye knoglemarv regenereres at overtage sin immunitet blev musene udfordret ved kemisk middel (dextrannatriumsulfat, DSS 5%) for at inducere colitis. Vi her viste også fremgangsmåden til at inducere colitis hos mus og vurdere rollen af genet af interesse udtrykkes fra knoglemarv afledte celler. Hvis genet af interesse fra knoglen afledte celler spiller en vigtig rolle i udviklingen af sygdommen (f.eks colitis), kan fænotypen af de recipientmus med knoglemarvstransplantation ændres væsentligt. Ved afslutningen af colitis eksperimenter, afledt af knoglemarv celler i blod og knoglemarv blev mærket med antistoffer mod CD45.1 og CD45.2 og deres kvantitative forhold mellem eksistens kan anvendes til at evaluere effekten af knoglemarvstransplantation ved flowcytometri. Vellykket knoglemarvstransplantation bør vise et stort flertal af donor genotype (på sigt af CD-molekyle markør) over modtager genotype i både knoglemarven og blod recipientmus.
Denne knoglemarvstransplantation fremgangsmåde er egnet til immunologiske forskning af colitis, infektion, cancer, fedme og andre sygdomme. Denne knoglemarvstransplantation eksperiment er nødvendig, når genet af interesse udtrykkes i både knogle afledt marv og ikke-knoglemarv-afledte celler, og genet af interesse er mistænkt for at mediere sygdom af celler fra nogen af populationerne. For eksempel antimikrobielle peptid cathelicidin vist sig at modulere akut colitis. Men det udtrykkes i både epithelceller og…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Pilot og gennemførlighedsundersøgelsen tilskud fra UCLA-CURE Center, Crohns og Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) og National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) finansiering til Hon Wai Koon.
Knoglemarv bestråling operation blev bistået af Bernard Levin og Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research muse / humant Chimera Core facilitet. Flowcytometri operation blev bistået af UCLA Vector Core facilitet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
Vaccutainer | BD | #8000813 |
Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |