Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation
Summary
Knoglemarvstransplantation tilvejebringer en måde at ændre genotype af knoglemarv-afledte celler. Hvis genet af interesse udtrykkes i både knoglemarvsafledte celler og ikke-knoglemarvsafledte celler, kan knoglemarvstransplantation ændre knoglemarv afledte celler til en anden genotype uden at ændre den ikke-knoglemarvsafledte celler genotype.
Abstract
For at forstå den rolle, et gen i udviklingen af colitis, sammenlignede vi svarene fra vildtype-mus og gen-af-interesse deficiente knockout-mus til colitis. Hvis genet af interesse udtrykkes i både knoglemarvsafledte celler og ikke-knoglemarvsafledte celler af værten, men det er muligt at skelne rollen af et gen af interesse i knoglemarv afledte celler og ikke-knoglemarv afledte celler ved knoglemarvstransplantation teknik. For at ændre knoglemarvsafledte celler genotype af mus, blev den oprindelige knoglemarv fra recipientmus ødelagt ved bestråling og derefter erstattes af nye donorknoglemarv af forskellige genotype. Når vildtype-mus donorknoglemarv blev transplanteret til knockout-mus, kunne vi generere knockout-mus med vildtype-genekspression i knoglemarv afledte celler. Alternativt blev da knockout mus donor knoglemarv transplanteres til vildtype-recipientmus, vildtype-mus uden gen af interesse udtrykkerfra knoglemarv afledte celler blev fremstillet. Imidlertid kan knoglemarvstransplantation ikke være 100% komplet. Derfor har vi udnyttet differentieringsklynge-(CD)-molekyler (CD45.1 og CD45.2) som markører for donor-og recipientceller at spore andelen af donorknoglemarv afledte celler i recipientmus og succes af knoglemarvstransplantation. Vildtypemus med CD45.1 genotypen og knockout mus med CD45.2 genotype blev anvendt. Efter bestråling af recipientmus, var donor knoglemarvceller hos forskellige genotyper infuseres ind i recipientmus. Når den nye knoglemarv regenereres at overtage sin immunitet blev musene udfordret ved kemisk middel (dextrannatriumsulfat, DSS 5%) for at inducere colitis. Vi her viste også fremgangsmåden til at inducere colitis hos mus og vurdere rollen af genet af interesse udtrykkes fra knoglemarv afledte celler. Hvis genet af interesse fra knoglen afledte celler spiller en vigtig rolle i udviklingen af sygdommen (f.eks colitis), kan fænotypen af de recipientmus med knoglemarvstransplantation ændres væsentligt. Ved afslutningen af colitis eksperimenter, afledt af knoglemarv celler i blod og knoglemarv blev mærket med antistoffer mod CD45.1 og CD45.2 og deres kvantitative forhold mellem eksistens kan anvendes til at evaluere effekten af knoglemarvstransplantation ved flowcytometri. Vellykket knoglemarvstransplantation bør vise et stort flertal af donor genotype (på sigt af CD-molekyle markør) over modtager genotype i både knoglemarven og blod recipientmus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne knoglemarvstransplantation fremgangsmåde er egnet til immunologiske forskning af colitis, infektion, cancer, fedme og andre sygdomme. Denne knoglemarvstransplantation eksperiment er nødvendig, når genet af interesse udtrykkes i både knogle afledt marv og ikke-knoglemarv-afledte celler, og genet af interesse er mistænkt for at mediere sygdom af celler fra nogen af populationerne. For eksempel antimikrobielle peptid cathelicidin vist sig at modulere akut colitis. Men det udtrykkes i både epithelceller og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Pilot og gennemførlighedsundersøgelsen tilskud fra UCLA-CURE Center, Crohns og Colitis Foundation of America Career Development Award (# 2691) og National Institute of Health NIDDK K01 (DK084256) finansiering til Hon Wai Koon.
Knoglemarv bestråling operation blev bistået af Bernard Levin og Scott Kitchen of UCLA Center for AIDS Research muse / humant Chimera Core facilitet. Flowcytometri operation blev bistået af UCLA Vector Core facilitet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Cell staining buffer | Biolegend | #420201 |
| 10X RBC lysis buffer | Biolegend | #420301 |
| FITC mouse isotype control | Biolegend | #400207 |
| PE mouse isotype control | Biolegend | #400211 |
| PE anti-mouse CD45.2 | Biolegend | #109807 |
| FITC anti-mouse CD45.1 | Biolegend | #110705 |
| Anti-mouse CD16/32 blocking | Biolegend | #101301 |
| 40 μm cell strainer | Fisherbrand | #22363547 |
| PBS 1X | MP biomedicals | #1860454 |
| Heparin | Fisherbrand | #BP2425 |
| Sulfatrim (SMZ) | Qualitest | NC9242720 (fisher) |
| Lysol IC | Andwin Scientific | NC9745686 (fisher) |
| Vaccutainer | BD | #8000813 |
| Mouse restrainer | Braintree Scientific | #TV-150 |
| Irradiator | J.L. Shepherd and Associates | Mark I 68A |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCanto II |
| Flow cytometer test tube | Falcon | #352052 |
| Digital caliper | Fisherbrand | 14-648-17 |
| Hemoccult ICT | Beckman Coulter | G0328QW |
References
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).
- Ungaro, R. A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).
- Castagliuolo, I. Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor. Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).
- Koon, H. W. Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice. Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).
- Lee, C. Y. marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement. PLoS One. 6, e11 (2011).
- Deng, X. New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis. Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).
- Valcz, G. Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa. J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).
- Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model. Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).
- Bakhautdin, B. Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. . Gut. , (2012).
- Seta, N., Kuwana, M. Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes. Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).
- Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells. J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).
- Finnberg, N. K. High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors. Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).
- Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).
- Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation. Blood. 103, 4344-4352 (2004).
