Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices
Summary
In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming Ca<sup> 2 +</sup> Signalen van GFP-gemerkte neuronen in hersenweefsel plakjes met een rode fluorescerende Ca<sup> 2 +</sup> Indicator kleurstof.
Abstract
Ondanks de enorme toename van de kennis van de onderliggende mechanismen van het coderen van informatie in de hersenen, een centrale vraag over de precieze moleculaire stappen en de activiteit van bepaalde neuronen in multifunctionele kernen van hersengebieden zoals de hypothalamus blijven. Dit probleem omvat de identificatie van de moleculaire componenten betrokken bij de regulatie van verschillende neurohormoon signaalcascades. Verhogingen van de intracellulaire Ca 2 + spelen een belangrijke rol in het reguleren van de gevoeligheid van neuronen, zowel op het niveau van signaaltransductie en synaptische plaatsen.
Nieuwe instrumenten ontstaan om neuronen in de veelheid van hersenneuronen identificeren door expressie green fluorescent protein (GFP) onder de controle van een specifieke promotor. Om zowel ruimtelijk als tijdelijk stimulus-geïnduceerde Ca 2 + volgen responsen in GFP-gelabelde neuronen, een niet-green fluorescent Ca 2 + n indicatorkleurstofeeds worden gebruikt. Bovendien is een confocale microscopie favoriete methode imaging individuele neuronen in weefselcoupes vanwege zijn vermogen om neuronen in verschillende vlakken diepte visualiseren in het weefsel en out-of-focus fluorescentie beperken. De ratiometrische Ca 2 + indicator fura-2 werd gebruikt in combinatie met GFP-gelabelde neuronen 1. Echter wordt de kleurstof geëxciteerd door ultraviolet (UV) licht. De kosten van de laser en de beperkte optische indringdiepte van UV licht belemmerd het gebruik in vele laboratoria. Bovendien kan GFP fluorescentie interfereren met de fura-2 signalen 2. Daarom was een rode fluorescerende Ca2 + indicator kleurstof te gebruiken. De enorme Strokes verschuiving van fura red-maakt multicolor analyse van het rode fluorescentie in combinatie met GFP met een excitatiegolflengte. We hadden eerder goede resultaten met behulp van fura-rood in combinatie met GFP-gemerkte olfactorische neuronen 3. De protocollen voor olfactorische weefselcoupes leek te e werkenqually goed in de hypothalamus neuronen 4. Fura-red gebaseerd Ca 2 + imaging werd eveneens met succes in combinatie met GFP-gelabelde pancreatische β-cellen en GFP-gemerkte receptoren tot expressie gebracht in HEK cellen 5,6. Een beetje gril van fura-rood is dat de fluorescentie-intensiteit bij 650 nm is lager dan de indicator bindt calcium 7. Daarom is de fluorescentie van rustende neuronen met lage Ca2 + concentratie relatief hoge intensiteit. Er zij opgemerkt dat andere rode Ca 2 +-indicatorkleurstoffen bestaan of zijn in ontwikkeling, zou dat een beter of betere resultaten in verschillende neuronen en hersengebieden.
Protocol
Discussion
Een belangrijke vraag in de neurowetenschappen is om te begrijpen hoe de hersenen sociale informatie verwerkt. Een grote bron van informatie die nodig is voor de sociale erkenning wordt gecodeerd door olfactorische of feromooncommunicatie signalen. De detectie van deze signalen door neuronale populaties in de neus en de erkenning van de signalen in de hersenen, vooral de hypothalamus, spelen een belangrijke rol in vele maatschappelijke processen en invloed hormonen en andere factoren neuroendocrine 13-16. Een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken onze collega's die hebben deelgenomen aan het werk samengevat hier. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), 'Integrative analyse van reukzin' de DFG Schwerpunktprogramm 1392 en door de Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ is een Lichtenberg hoogleraar van de Volkswagen Stichting.
Materials
| Name | Company | Cat. N° |
| Agar | Sigma | A1296 |
| Fura-red/AM | Invitrogen | F-3021 |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 |
| Vibrating-Blade Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9770170 |
| Cooling Device CU 65 for Microtome Hyrax V 50 | Zeiss | 9920120 |
| O2/CO2 Incubator, CB210-UL | Binder | 0019389 |
| Super glue, Loctite 406TM | Henckel | 142580 |
| Double spatulas, spoon shape | Bochem | 3182 |
| Microspoon spatulas, spoon shape | Bochem | 3344 |
| Spring Scissors, Moria-Vannas-Wolff – 7mm Blades | Fine Science Tools | 15370-52 |
| Spring Scissors, Vannas – 3mm Blades | Fine Science Tools | 15000-00 |
| Wagner Scissors | Fine Science Tools | 14071-12 |
| Medical Forceps, Dumont 7b | Fine Science Tools | 11270-20 |
| Large Rectangular Open Bath Chamber (RC-27) | Warner Instruments | 64-0238 |
| Confocal Microscope BioRad Radiance 2100 | Zeiss | n.a. |
References
- Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations. Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).
- Bolsover, S., Ibrahim, O., O’Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions. Biochem. J. 356, 345-352 (2001).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).
- Wen, S. Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain. Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).
- Hara, M. Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).
- Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).
- Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers. Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).
- Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes. Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).
- Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).
- Wen, S. Functional characterization of genetically labeled gonadotropes. Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms. ILAR J. 50, 28-42 (2009).
- Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility. Cell. 123, 669-682 (2005).
- Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction. Cell. 123, 683-695 (2005).
- Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse. J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).
- Hu, J. Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse. Science. 317, 953-957 (2007).
- Perez, C. A. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).
- Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes. Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).
- Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Properties of Asante Calcium Red – a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. , (2010).
