मानव मानव neuroendocrine ट्यूमर चिकित्सा के अध्ययन के लिए एक तीन आयामी मॉडल के रूप में neuroendocrine ट्यूमर सेल लाइनों

Summary

हम एक सरल agarose उपरिशायी 3D multicellular spheroids neuroendocrine कैंसर कोशिका लाइनों का उपयोग बढ़ने मंच प्रस्तुत करते हैं. इस विधि neuroendocrine ट्यूमर कोशिकाओं पर चिकित्सीय औषधियों के प्रभाव की जांच के लिए एक बहुत ही सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है. यह भी हमें कैंसर के उपचार के लिए मानव neuroendocrine ट्यूमर spheroids की स्थापना में मदद कर सकता है.

Abstract

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100, 000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human malignancies.¹ Other than surgery for the minority of patients who present with localized disease, there is little or no survival benefit of systemic therapy. Therefore, there is a great need to better understand the biology of NETs, and in particular define new therapeutic targets for patients with nonresectable or metastatic neuroendocrine tumors. 3D cell culture is becoming a popular method for drug screening due to its relevance in modeling the in vivo tumor tissue organization and microenvironment.^2,3 The 3D multicellular spheroids could provide valuable information in a more timely and less expensive manner than directly proceeding from 2D cell culture experiments to animal (murine) models.

To facilitate the discovery of new therapeutics for NET patients, we have developed an in vitro 3D multicellular spheroids model using the human NET cell lines. The NET cells are plated in a non-adhesive agarose-coated 24-well plate and incubated under physiological conditions (5% CO₂, 37 °C) with a very slow agitation for 16-24 hr after plating. The cells form multicellular spheroids starting on the 3^rd or 4^th day. The spheroids become more spherical by the 6^th day, at which point the drug treatments are initiated. The efficacy of the drug treatments on the NET spheroids is monitored based on the morphology, shape and size of the spheroids with a phase-contrast light microscope. The size of the spheroids is estimated automatically using a custom-developed MATLAB program based on an active contour algorithm. Further, we demonstrate a simple method to process the HistoGel embedding on these 3D spheroids, allowing the use of standard histological and immunohistochemical techniques.

This is the first report on generating 3D spheroids using NET cell lines to examine the effect of therapeutic drugs. We have also performed histology on these 3D spheroids, and displayed an example of a single drug’s effect on growth and proliferation of the NET spheroids. Our results support that the NET spheroids are valuable for further studies of NET biology and drug development.

Protocol

1. 1 agarose लेपित% 24 अच्छी तरह से प्लेट की तैयारी 1 ग्राम agarose (आरपीआई, A20090-500) 250-500 मिलीलीटर बोतल और आटोक्लेव में 100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी बाँझ बनाना करने के लिए agarose (121 डिग्री सेल्सियस 15, साई, एक आटोक्लेव मशीन में 15 मिनट). एक 70 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में निष्फल agarose के साथ बोतल स्थानांतरण. agarose जब यह 70 डिग्री सेल्सियस है, जो के बारे में एक घंटा लगता है ठंडा करने के लिए है डाला जा करने के लिए तैयार है. हर समय agarose बाँझ रखने के लिए सुनिश्चित करें. 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट (फाल्कन, 353,047) प्राप्त; 24 फ्लैट नीचे प्लेटों के किसी भी तरह अगर प्लेट चरण विपरीत एक खुर्दबीन के तहत imaged किया जा सकता है काम करेगा. प्रत्येक अच्छी तरह से एक जैव सुरक्षा कैबिनेट और अच्छी तरह से चारों ओर agarose ज़ुल्फ़ के लिए यह अच्छी तरह से समान रूप से कवर में एक Eppendorf पुनरावर्तक विंदुक के साथ agarose की 200 μl बांटना. Agarose की 200 μl एक अवतल सतह के रूप में इतनी है कि spheroids संगत गोलाकार आकार के रूप में कर सकते हैं उपयुक्त है. कम से कम 200 μl agarose नहीं हो सकताअच्छी तरह से पूरी तरह कवर, लेकिन 200 से अधिक μl agarose अवतल सतह और उस पर हो spheroids फार्म नहीं हो सकता है गोलाकार आकार फार्म नहीं हो सकता है. agarose – लेपित 24 अच्छी तरह से प्लेटों के बारे में 10 मिनट में इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार हैं. (वैकल्पिक) संस्कृति के माध्यम से agarose बोने की कोशिकाओं को पहले से संतुलित करना मध्यम 100 μl जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, के बाद agarose पूरी तरह से जम जाता है, एक अच्छी तरह से 100 μl विकास मध्यम जोड़ और बाँझ सील टेप (Nunc, 236,366) के साथ प्लेटें सील. इन प्लेटों को एक सप्ताह तक के लिए डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहीत किया जा सकता है. 2. एकल कक्ष निलंबन की तैयारी सभी प्रयोगों एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाता है और सभी संस्कृतियों हवा में 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में बड़े हो रहे हैं, जब तक निर्दिष्ट. मानव अग्नाशय. NET बॉन 1 कोशिकाओं DMEM/F12 (Invitrogen, 10,565) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, Invitrogen के साथ रखा जाता है,16000-044 100 मिमी में) मध्यम x 20 मिमी बाँझ ऊतक संस्कृति पकवान (Corning है, 430,167). जब monolayer बॉन 1 कोशिकाओं 70-80% confluency तक पहुँचने, मध्यम निकाल दिया जाता है. कोशिकाओं पीबीएस के साथ धो रहे हैं दो बार, और 5 मिनट ऊष्मायन के साथ 1 मिलीलीटर TrypLE है (Invitrogen, 12,604) 37 डिग्री सेल्सियस जोड़ने के द्वारा पकवान से उखाड़ फेंकना TrypLE trypsin के लिए इसी तरह की है, लेकिन 15 पर स्थिर है – 30 डिग्री सेल्सियस के रूप में अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस खुर्दबीन के नीचे की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को पकवान से अलग कर रहे हैं. Trypsinized कोशिकाओं 9 मिलीग्राम वृद्धि मध्यम जोड़ें और कोशिकाओं विंदुक ऊपर और नीचे कुछ समय के लिए एक भी एकल कक्ष निलंबन को सुनिश्चित करने के लिए एक विंदुक उपयोग के. 70 माइक्रोन सेल छलनी (फिशर, 22,363,548) का प्रयोग करने के लिए कोशिकाओं को फिल्टर करने के लिए. कोशिकाओं को इकट्ठा और एक सेल गिनती अमरूद पीसीए 96 बेस सिस्टम (Millipore) का उपयोग कर प्रदर्शन. 10% FBS मध्यम विकास के साथ में phenol मुक्त DMEM/F12 मिलीलीटर प्रति 5,000 कोशिकाओं के निलंबन तैयार. 3. उपगोल संस्कृति ओवरले के एकल 200 μlagarose लेपित प्लेट 24 अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन और वाष्पीकरण को रोकने के लिए बाँझ सील टेप के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें सील. नोट: चढ़ाया जा कोशिकाओं की संख्या 6 दिन में spheroids के आकार के आधार पर किया जा empirically का निर्धारित होना चाहिए, 300-400 माइक्रोन व्यास spheroids की दवा इलाज शुरू करने के लिए आदर्श आकार होगा, हज़ार बॉन-1 और H727 कोशिकाओं को चढ़ाया जाता है. हम 6 दिन के बाद दवा उपचार शुरू करने की सिफारिश नहीं क्योंकि 3D कोशिकाओं की व्यवहार्यता के बारे में 10 दिन (डेटा तैयार करने में पांडुलिपि नहीं दिखाया,) में ड्रॉप करने के लिए शुरू होता है. बॉन-1 कम से कम 40 हवा में 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर में रातोंरात आरपीएम की एक बहुत ही धीमी गति से आंदोलन पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर कोशिकाओं के साथ ऊपर agarose में लिपटे 24 अच्छी तरह प्लेटें रखें. फिर एक स्थिर मंच इन प्लेटों को स्थानांतरित करने के लिए संस्कृतियों बढ़ती रखने. ऊपर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए 200 μl मध्यम विकास जोड़ेंहर 3 दिन. Spheroids परेशान नहीं. विंदुक टिप को अच्छी तरह से किनारे को छू और मध्यम प्रवाह में अच्छी तरह से नीचे दे द्वारा एक अच्छी तरह की दीवार के माध्यम से मध्यम जोड़ने की कोशिश करो. एक खुर्दबीन के नीचे 24 अच्छी तरह से प्लेट में उपगोल गठन मॉनिटर. 4. औषध उपचार जब spheroids 6 दिन में व्यास में लगभग 300-400 माइक्रोन तक पहुँचने, 3 डी spheroids दवाओं के साथ व्यवहार कर रहे हैं. इस दवा के इलाज के लिए दिन 0 के रूप में चिह्नित है. 6 दिन, प्लेट की हर अच्छी तरह से मध्यम के चारों ओर 400 μl शामिल हैं. यकीन है कि नशीली दवाओं के उपचार के उपचार के प्रत्येक खुराक के प्रत्येक अच्छी तरह से, 3x धारावाहिक dilutions में 1x अंतिम एकाग्रता में कर रहे हैं एक 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूब है, जो 8 के लिए पर्याप्त है प्रतिकृति में 5 मिलीलीटर विकास के माध्यम दवा स्टॉक से बना. 24 अच्छी तरह से थाली की प्रत्येक पंक्ति पर spheroids वाहन, खुराक 1, 2, 3, 4 और 5 के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं. वहाँ 4 एक 24 अच्छी तरह से थाली पर उपचार के प्रत्येक खुराक के लिए प्रतिकृति (देखें <stroएनजी> तालिका 1). हम आम तौर पर कम से कम 2 24 अच्छी तरह प्लेटें, जो कम से कम 8 बनाती उपचार के प्रत्येक खुराक के लिए प्रतिकृति में 3 डी spheroids का इलाज. 800 rpm पर 5 मिनट के लिए 4 में 24 अच्छी तरह से थाली स्पिन ° यकीन है कि सील टेप पर सभी condensations में अच्छी तरह से जाना बनाने के सी. 3 डी spheroids की अस्थायी विशेषता के कारण, हर अच्छी तरह से में मध्यम spheroids की अशांति से बचने के लिए नहीं निकाल दिया जाता है. ध्यान से प्रत्येक अच्छी तरह की दीवार के साथ उचित कुओं में प्रत्येक खुराक के ऊपर बनाया उपचार के 200 μl जोड़ने. सील टेप सील के साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें और 37 में संस्कृतियों सेते हैं डिग्री सेल्सियस हवा में 5% सीओ साथ humidified इनक्यूबेटर 2. यदि आवश्यक हो, एक अच्छी तरह पर 72-96 घंटे के बाद उपचार के संबंधित खुराक के साथ spheroids पीछे हटना. 5. मॉनिटर 3 डी उपगोल संस्कृति प्रत्येक चुना दवा उपचार के बाद समय बिंदु (0, 24, 48, घंटा 72), टी के प्रत्येक अच्छी तरह से spheroidsवह 24 अच्छी तरह से थाली एक Zeiss Axiovert 200/M-based चरण विपरीत एक 5x उद्देश्य का उपयोग कर खुर्दबीन के साथ imaged किया जाता है. नोट: छवियाँ माइक्रोन और पिक्सेल के बीच एक calibrated स्केलिंग के साथ किसी भी प्रकाश माइक्रोस्कोप पर लिया जा सकता है. एक 5x उद्देश्य के लिए आदर्श है क्योंकि spheroids जल्दी से एक 10x उद्देश्य के साथ इमेजिंग क्षेत्र विकसित हो जाना. उपगोल विश्लेषण मैन्युअल रूप से प्रदर्शन किया जा सकता है कच्चे छवियों के साथ Zeiss AxioVision 4.8.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. वैकल्पिक रूप से, एक कस्टम विकसित MATLAB के कार्यक्रम spheroids का आकार स्वतः / अर्द्ध स्वचालित रूप से अनुमान किया जाता है. स्वत: सक्रिय समोच्च 4 एल्गोरिथ्म करने के लिए सही एक दिया छवि में उपगोल की समोच्च का पता लगाने और (एल) प्रमुख और गौण अक्षों (डब्ल्यू) स्वचालित रूप से मापने के कार्यक्रम लागू करता है. एक ही एल्गोरिथ्म के एक अर्द्ध स्वचालित संस्करण के उपयोगकर्ताओं की मदद करने के लिए कार्यक्रम आरंभ जब मजबूत विरूपण साक्ष्य मौजूद है की अनुमति देता है. सभी छवियों से झगड़ा या JPEG फ़ाइल स्वरूपों के रूप में निर्यात किया जा आवश्यकताकच्चे छवियों प्रोग्राम द्वारा पढ़ा जा. उपगोल की मात्रा 0.5 एक्स एल एक्स 2 डब्ल्यू के रूप में अनुमान लगाया गया है. 6. को शुद्ध 3D spheroids HistoGel – एम्बेडिंग 10-24 spheroids 24 अच्छी तरह प्लेटें से एकत्र कर रहे हैं, पीबीएस में धोया दो बार, 10% 2 घंटे के लिए formalin में तय, 50% में धोया और दो बार 15 मिनट के लिए 70% इथेनॉल, क्रमशः, और HistoGel एम्बेडिंग के लिए तैयार हैं. वैकल्पिक रूप से, वे 70% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर जा सकता है कई महीनों के लिए रखा. ठंड HistoGel (थर्मो वैज्ञानिक, पारा 4000-012) की एक ट्यूब में पानी से भरे बीकर में डाल दिया है. बीकर 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव में गरम किया जाता है या जब तक जेल पूरी तरह से तरलीकृत है, तो हर समय एक ही पानी से भरे बीकर में रखा. ऊपर से 70% इथेनॉल में spheroids एक बायोप्सी (ऊतक टेक, Sakura, Finetek, 4565) cryomold एक दंर्तखोदनी का उपयोग कर में स्थानांतरित कर रहे हैं. सुनिश्चित करें कि सभी spheroids स्थानांतरित कर रहे हैं. Spheroids एक मिनट के लिए बैठते हैं जैव के नीचे करने के लिए नीचे सिंकमनोचिकित्सक cryomold. करने के लिए Kimwipes साथ बायोप्सी cryomold में तरल पदार्थ से छुटकारा पाने के लिए और इस बीच, बहुत धीरे बायोप्सी cryomold के तल पर केंद्र डिस्पोजेबल प्लास्टिक पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए spheroids धक्का की कोशिश करो. यह कदम विदारक माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना आसान हो सकता है. गर्म HistoGel की एक पतली परत में बायोप्सी cryomold करने के लिए जोड़ा जाता है लिए बायोप्सी cryomold नीचे spheroids को स्थिर, इस बीच, दन्तखुदनी बहुत बायोप्सी cryomold के तल पर धीरे केंद्र पर spheroids रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. बायोप्सी cryomold के नीचे spheroids को स्थिर करने के लिए जोड़ नहीं है, लेकिन बहुत ज्यादा HistoGel बस पर्याप्त है. Spheroids / HistoGel कमरे के तापमान पर या जब तक HistoGel जम जाता है 1-2 मिनट के लिए बैठते हैं. फिर गर्म HistoGel साथ बायोप्सी cryomold के बाकी भरें. यह कमरे के तापमान पर के बारे में 10 मिनट के लिए जमना करने के लिए अनुमति देते हैं. बस से पहले बायोप्सी cryomold, घास का मैदान से बाहर popping के spheroids / HistoGel ब्लॉकडिग्री सेल्सियस 4 में 1 मिनट है, जो बाहर popping के बरकरार spheroids / HistoGel ब्लॉक में मदद करता है के लिए गए. spheroids / HistoGel ब्लॉक तो जैव wraps के एक टुकड़ा (Surgipath, 01,090) में लपेटा जाता है और एक ऊतक और बायोप्सी (फिशर साइंटिफिक, 15-182 701D) कैसेट में डाल दिया. ऊतक और बायोप्सी कैसेट 70% इथेनॉल के साथ एक कंटेनर में संग्रहीत किया जाता है. तो आयल एम्बेडिंग के लिए नियमित ऊतक प्रसंस्करण प्रक्रिया का पालन कर रहे हैं 5 तेल ब्लॉक 3 माइक्रोन मोटी परत स्लाइड में sectioned हो सकता है. स्लाइड लाल भामसान रंग hematoxylin और साथ कलंकित किया जा सकता है लिए ऊतकीय परिवर्तन का निर्धारण और भी immunohistochemical धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 7. प्रतिनिधि परिणाम मानव अग्नाशय neuroendocrine ट्यूमर सेल (Kjell Oberg, अपसला विश्वविद्यालय, स्वीडन द्वारा Verto संस्थान के) प्रदान बॉन-1, QGP 1 (जापानी स्वास्थ्य विज्ञान फाउंडेशन, ओसाका, जापान), और मानव फेफड़ों neuroendocrine ट्यूमर कोशिका लाइन H727 (ATCC) लाइनों एक agaros पर होई – लेपित प्लेट 24 अच्छी तरह से. जैसा कि चित्र 1 में देखा, तीन सेल लाइनों विभिन्न आकारिकी दिखा. बॉन-1 और H727 कोशिकाओं 3D spheroids का गठन किया था. खुर्दबीन के नीचे, H727 कोशिकाओं के बॉन-1 कोशिकाओं की तुलना में सख्त और अधिक कॉम्पैक्ट spheroids दिखाया. हम परिकल्पना है कि H727 कोशिकाओं सेल कोशिका आसंजन के लिए एक वृद्धि की क्षमता है और एक परिणाम के रूप में तंग जंक्शनों फार्म. QGP 1 कोशिकाओं बड़े अंगूर की तरह झरझरा जनता, जो spheroids के रूप में नहीं माना जाता है दिखाते हैं. हाल के वर्षों में अग्नाशय neuroendocrine ट्यूमर अनुसंधान की बढ़ती रुचि के कारण, बॉन-1 कोशिकाओं आंकड़ों के बाकी के लिए उपयोग किया जाता है. बॉन एक agarose लेपित प्लेट 24 अच्छी तरह से कोशिकाओं पर बोने के बाद, multicellular spheroids गठन आम तौर पर 3 या 4 वें दिन के द्वारा होता है और spheroids 6 वें दिन से राउंडर हो जाते हैं. पोषक तत्व और ऑक्सीजन की सीमा के कारण, spheroids के घने कोर में कोशिकाओं को चारों ओर 10 दिन और 17 दिन से मरने शुरू, spheroids बड़े आकार की वजह से या तो में बिखर शुरूमुझे अतक्षिय कोर के इंजेक्शन मामलों. spheroids आमतौर पर व्यास में 1,000 माइक्रोन बढ़ने चित्रा 2 बॉन-1 3D spheroids का गठन, और विकास विघटन की वर्गों से पता चलता है. कर सकते हैं. दवा उपचार शुरू कर दिया गया जब spheroids थे 300-400 के आसपास माइक्रोन और कोशिकाओं उच्च व्यवहार्यता (पांडुलिपि तैयार करने में) को बनाए रखा. 6 दिन 3 डी spheroids दवा उपचार के लिए प्रारंभ बिंदु के रूप में चुना गया था. यह बताया गया है कि histone deacetylase inhibitors. NET कोशिकाओं के पर antiproliferative और proapoptotic प्रभाव से पता चला है 6. हम histone deacetylase अवरोध करनेवाला Trichostatin चुना 3A से पता चलता है (TSA) के एक 3D. NET spheroids पर नशीली दवाओं के उपचार के प्रभाव को बताने के लिए एक उदाहरण के रूप में. चित्रा TSA 3B. चित्रा के उपचार पर 3 डी spheroids की आकारिकी (सिग्मा, T8552) TSA के इलाज पर 3 डी spheroids की मात्रा से पता चलता है. प्रत्येक व्यक्ति अंडाकार आकृति का आकार स्वचालित रूप से ग्राहकों द्वारा अनुमान लगाया गया थाMATLAB के कंप्यूटर प्रोग्राम टॉम विकसित 4 एक पुस्तिका ड्राइंग कदम spheroids, जो एक दिया छवि में किनारे के करीब थे हासिल करने में मदद करने के लिए जोड़ा गया है. कम से कम 8 spheroids TSA के उपचार की खुराक के प्रति हर समय बिंदु पर मापा गया. प्रत्येक 3 डी उपगोल की मात्रा 0.5 एक्स लंबाई x 2 चौड़ाई के रूप में गणना की गई. के रूप में चित्रा 3A और 3B, वाहन के सापेक्ष में देखा, TSA की सभी खुराक के आंकड़े में दिखाया बॉन-1 3D spheroids का विकास निषेध के कुछ डिग्री का प्रदर्शन किया. उनमें से, 125 एनएम और TSA के 250 एनएम की सांद्रता दृढ़ता से 3 डी spheroids के विकास को दबा दिया और 96 घंटा समय बिंदु में कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व किया. . NET 3D spheroids के ऊतक विज्ञान को समझने के लिए, एक और एच ई और immunohistochemical धुंधला (आईएचसी) पर संवर्धित किया गया था कि 17 दिनों के लिए 3 डी spheroids प्रदर्शन किया गया 4A चित्रा विधि लिए 3 डी HistoGel एम्बेडिंग के लिए spheroids प्रक्रिया है, जो कुंजी है दिखाता है. के आयल एम्बेडिंग के लिए 3 डी spher कदम OIDs 4B चित्रा और एच ई धुंधला हो जाना, cleaved कस्पासे (apoptotic कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) 3 और की-67 के immunohistochemical धुंधला (सेल proliferating के लिए एक मार्कर) 3 डी spheroids पर एंटीबॉडी, जो 17 दिनों के लिए संवर्धित किया गया था से पता चलता है . 3D spheroids की कोर के भीतर कोशिकाओं ज्यादातर अतक्षिय / apoptotic हैं और बाहरी परत की कोशिकाओं को सक्रिय रूप से proliferating हैं. आकृति 1. . NET 3D spheroids की आकृति विज्ञान तीन मानव neuroendocrine ट्यूमर सेल लाइनों से 3 डी spheroids agarose लेपित 24 – अच्छी तरह से प्लेटों पर गठन कर रहे हैं. दस सौ बॉन-1, H727 और QGP-1 कोशिकाओं agarose लेपित 24 – अच्छी तरह से प्लेट पर वरीयता प्राप्त थे और प्रोटोकॉल में विस्तृत रूप में एक सामान्य शारीरिक हालत में हो. QGP-1 के लिए बॉन-1 और H727 या सेल समुच्चय है, जो 10 दिनों के लिए संवर्धित किया गया के लिए 3 डी spheroids की छवियों हैं. "Alt =" 18/4218fig2.jpg चित्रा 2 "/> चित्रा 2. बॉन-1 3 डी spheroids का विकास ट्रैकिंग बॉन एक 3 डी spheroids के विकास पर नज़र रखने के गठन, विकास, और 3 डी spheroids का विघटन. के रूप में प्रोटोकॉल में विस्तृत, 1000 बॉन एक कोशिकाओं agarose 24 अच्छी तरह से लेपित प्लेट पर चढ़ाया जाता है. कोशिकाओं एक मानक DMEM/F12 मध्यम में एक शारीरिक हालत में रात भर एक कक्षीय हिलनेवाला पर 10% FBS के साथ बड़े हो रहे हैं, तो एक स्थिर मंच पर ले जाया गया और उसी हालत में हो. 3 डी कोशिकाओं के विकास पर नज़र रखने चढ़ाना के बाद पहली बार 5 घंटे के लिए हर घंटे इमेजिंग कोशिकाओं द्वारा पीछा किया गया था, और तब एक Zeiss Axiovert के साथ हर 1-3 दिनों चरण विपरीत एक 5x उद्देश्य का उपयोग कर खुर्दबीन 200/M-based. पहले आम जनता में कुल कोशिकाओं, तो multicellular समुच्चय, छोटे spheroids, बड़ा spheroids, और अंततः spheroids बिखर फार्म. चित्रा 3. बॉन 1 पर TSA के उपचार3 डी spheroids (ए) TSA के इलाज पर 3 डी spheroids की छवियाँ. उपचार समूह: वी – वाहन (.0025% DMSO के), 1 डी 1 – खुराक (15.625 एनएम टीएसए), 2 डी 2 खुराक (31.25 एनएम टीएसए), डी 3: 3 खुराक (62.5 एनएम टीएसए), D4: 4 खुराक (125 एनएम टीएसए ), D5: 5 खुराक (250 एनएम टीएसए). उपचार के समय: 0 एच – टाइम का कहना है कि पर शुरू उपचार 6 3D spheroids दिन, 24 घंटे, 48 एच एच 72, और 96 एच अंक हैं के बाद उपचार शुरू कर दिया. 3D spheroids प्रत्येक समय के रूप में पहले बिंदु पर imaged थे. (बी) TSA के इलाज पर 3 डी spheroids का विकास. (एल) प्रमुख और गौण (डब्ल्यू) (ए) में 3 डी spheroids के अक्षों Matlab कार्यक्रम द्वारा स्वचालित रूप से उपचार की हर समय बिंदु (0, 24, 48, 72 और 96 घंटे) में अनुमान लगाया गया था. 3D spheroids की मात्रा 0.5 एक्स एल एक्स 2 डब्ल्यू के रूप में अनुमान लगाया गया था. ग्राफ में उपगोल की मात्रा 8 की औसत replicates और त्रुटि पट्टी प्रतिकृति 8 के आधार पर गणना की गई. तालिका 1.24 अच्छी तरह से एक थाली पर नशीली दवाओं के उपचार के लेआउट. 4A आंकड़ा. करने के लिए एक 3 डी HistoGel एम्बेडिंग के लिए spheroids प्रक्रिया विधि का चित्रण एक विधि HistoGel embedding और 3 डी (ए) विधि 3 डी HistoGel एम्बेडिंग के लिए spheroids प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन spheroids की immunohistochemical धुंधला के लिए 3 डी spheroids प्रक्रिया. 3 डी spheroids HistoGel में थे समझाया बायोप्सी के cryomold में एक ही स्तर, तो HistoGel / spheroids ब्लॉक जैव wraps नीले में लपेटा गया था और आयल embedding के लिए एक पीले रंग की बायोप्सी कैसेट में स्थानांतरित में. 4B आंकड़ा. एच ई धुंधला और दिन के 17 3D spheroids की immunohistochemical धुंधला (बी) और एच ई धुंधला हो जाना, की 67 immunohistochemical धुंधला हो जाना और Cleaved 17 दिन 3 डी spheroids कस्पासे 3.आयल – एम्बेडेड sectioned स्लाइड deparaffinized थे और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति सीसीआई (सेल कंडीशनिंग समाधान, Verana की चिकित्सा प्रणाली, 711-065-152 #) का उपयोग किया गया था. खरगोश पॉलीक्लोनल की 67 (Abcam. Ab833) एंटीबॉडी और Cleaved कस्पासे 3 एंटीबॉडी (सेल संकेतन प्रौद्योगिकी, # 9661) 1:75 और 1:200 के एक एकाग्रता पर लागू किया गया, कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए क्रमशः,. विरोधी खरगोश माध्यमिक एंटीबॉडी (जैक्सन Immunolab, 711-065-152 #) 1:500 में 1 घंटे के लिए लागू किया गया था कमरे के तापमान पर, वर्णजनीय पता लगाने किट DABMap (Ventana मेडिकल सिस्टम्स, 760-124 #) द्वारा पीछा किया. स्लाइड्स Hematoxylin और निर्जलित के साथ counterstained गया और Xylene से coverslipping से पहले मंजूरी दे दी.

Discussion

हम मानव neuroendocrine ट्यूमर कोशिकाओं agarose – लेपित 24 – अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर से 3 डी multicellular उपगोल के गठन के लिए एक सरल, विश्वसनीय, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का प्रदर्शन किया है. इस तकनीक की सफलता के समरूप आकार और कक्षों की एक निश्चित संख्या से शुरू 6 दिन के समान आकार के साथ एक एकल उपगोल प्राप्त करने की क्षमता है. महत्वपूर्ण कदम चढ़ाना के बाद पहले 16-24 घंटे के लिए नेट कोशिकाओं के साथ प्लेट की धीमी गति से आंदोलन है. इस विधि में भी लागू कर सकते हैं आम मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइन MCF-7, मानव बृहदान्त्र ग्रंथिकर्कटता सेल लाइन HT – 29, मानव गैर छोटे सेल फेफड़ों कार्सिनोमा सेल H1299 लाइन और मानव भ्रूण गुर्दे सेल लाइन HEK-293. वे सब वर्दी और कॉम्पैक्ट 3 डी spheroids चिकित्सकीय दवा स्क्रीन (नहीं दिखाया डेटा) के लिए फार्म कर सकते हैं. हालांकि कई तरीकों 3D spheroids पैदा करने पर रिपोर्ट कर रहे हैं, ^7-10 विधि यहां बताया विशेष प्लेटों या अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है और इस प्रकार सरल और लागत प्रभावी है. हमारे अप्रकाशित डेटा demonstratई कि. NET 3D agarose पर हो spheroids vivo में. NET xenograft ट्यूमर में ज्यामितीय और molecularly नकल, जब में monolayer 2D कोशिकाओं की तुलना में. यह क्या 3 डी से अन्य मानव कैंसर कोशिका लाइनों पर किए गए spheroids के लिए सूचित किया गया है के समान है ^11,12 3 डी सेल संस्कृति मॉडल की सीमा है कि यह पूरी तरह से किसी भी दवाओं या उपचार के उपचार के vivo प्रभावकारिता में परीक्षण को बदल नहीं सकते. क्योंकि 3 डी spheroids में avascular ट्यूमर की तरह हैं, जो इस पहलू में vivo ट्यूमर में से अलग है. बहरहाल, इस विधि का अंतर और. NET चिकित्सीय औषधियों के आकलन के कुछ पहलुओं में से इन विट्रो में vivo में पाटने में मदद मिलेगी.

बड़े आकार और चल 3D spheroids की ज्यामिति और confocal सूक्ष्मदर्शी की सीमा के कारण प्रदर्शन multicellular spheroids पर immunofluorescence धुंधला हो जाना बहुत मुश्किल है. यहाँ हम तेल के लिए HistoGel एम्बेडिंग प्रक्रिया विधि उदाहरण देकर स्पष्ट करनाएम्बेडिंग, 3 डी spheroids के धारावाहिक sectioned स्लाइड्स की immunohistochemical धुंधला अनुमति. इसके अलावा, हमारे कस्टम विकसित MATLAB कार्यक्रम में मदद करता है सही और reproducibly spheroids के आकार का अनुमान है, कुशलतापूर्वक दवा प्रभावकारिता की निगरानी, ​​और. NET रोगियों के लिए दवाओं के विकास में एक उच्च throughput स्क्रीन में शामिल किया जा सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12 Media	Gibco	10565-018
TrypLE	Gibco	12604
24-well plates	Falcon	353047
70 mM cell strainer	Fisher Scientific	22363548
Sterile sealing tape	Nunc	236366
Trichostatin A	Sigma	T8552
Orbital Shaker	Fisher Scientific	11-402-12