Glycosphingolipid प्रतिजनों के बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण
Summary
एक विशिष्ट और संवेदनशील प्रतिरक्षा अंगों और कोशिकाओं में glycosphingolipid प्रतिजनों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए एक विधि का वर्णन है. विधि आयन जाल मास रासायनिक संश्लेषित मानकों की तुलना में कदम वार संरचनात्मक विश्लेषण के लिए glycosphingolipid अणुओं के विखंडन की अनुमति स्पेक्ट्रोमेट्री का लाभ लेता है.
Abstract
Glycosphingolipids (GSL’s) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.
Protocol
Representative Results
Discussion
glycome, एक जीनोम और proteome सादृश्य में गढ़ा शब्द, एक जीव की सभी सैकराइड संरचनाओं के लिए संदर्भित करता है. ग्लाइकोसिलेशन के कई गुना कार्य करने के लिए पूरी तरह से समझ दोनों कार्यात्मक और संरचनात्मक Glycomics अध्ययन सहित एक एकीकृत दृष्टिकोण की आवश्यकता होगी. दोनों गैर टेम्पलेट glycan biosynthesis, जिसके परिणामस्वरूप और glycan संरचनाओं की जटिलता और विविधता, आणविक स्तर पर modulating glycan ligand-रिसेप्टर बातचीत में aglycone संरचना के लगातार भागीदारी, और कम बहुतायत ligands के कार्यात्मक महत्व की प्रकृति द्वारा संचालित जटिल हैं.
यह आम तौर पर स्वीकार किया है कि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) की पहचान और निस्र्पक कम बहुतायत ligands के लिए विशेष रूप से संरचनात्मक Glycomics अध्ययन, के लिए एक अनिवार्य विधि है. आणविक प्रजाति के रूप में या glycans glycoconjugates का पालन करने के लिए, हम अक्सर एक अत्यंत कुशल, कम ऊर्जा ionization विधि, electrospray ionization (ईएसआई) कहा जाता है का उपयोग करें. अधिक det के लिएglycan संरचना के लक्षण वर्णन ailed, यह जरूरी है कि व्यक्तिगत आणविक प्रजातियों का चयन करें और छोटे टुकड़ों में glycans को तोड़ने. यह आम तौर पर टक्कर प्रेरित हदबंदी जो अक्रिय गैस अणुओं के साथ टकराव के माध्यम से glycans को सक्रिय शामिल किया जाता है. वृद्धि हुई ऊर्जा बंधन टूटना लाती है, और परिणामस्वरूप टुकड़े के व्यवस्थित विश्लेषण glycan के आणविक संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करता है. अक्सर, "हस्ताक्षर" टुकड़े उत्पन्न हो सकता है कि विशेष glycan ढांचागत सुविधाओं के लिए निदान कर सकते हैं. आणविक जन के साथ साथ, इन टुकड़ों को कभी कभी glycans की पहचान करने के लिए पर्याप्त हो सकते हैं, लेकिन अतीत में बहुत अधिक जानकारी के लिए पूरी तरह से उन्हें चिह्नित की आवश्यकता है, खासकर अगर संरचना उपन्यास है. इन विधियों चीनी रचना विश्लेषण, गैस संबंध विश्लेषण के लिए आंशिक रूप से methylated alditol एसीटेट का क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, और विशिष्ट glycosidase 17 पाचन शामिल हैं.
<p class=> "Jove_content" के रूप में पिछले 18-19 दशक से अधिक प्रदर्शन, कम ऊर्जा विखंडन, जो एक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर में प्रभावी ढंग से किया जा सकता है बाहर किया जाता है (आईटी – एमएस) के कई दौर, बहुत glycan जन वर्णक्रमीय विश्लेषण से जानकारी उपज में सुधार . विखंडन (जो अन्य एमएस उपकरणों के साथ नहीं किया जा सकता है) के चार या पांच दौर के साथ, यह संभव है कि एक ही चीनी विभिन्न चीनी लिंकेज में व्यवस्थित घटक होते समाजिक glycans भेद, तब भी जब इन वर्तमान के साथ उसी के साथ घटकों के मिश्रण में हैं आणविक द्रव्यमान (isobars). इस विश्लेषण के लिए, glycans derivatized थे, मिथाइल permethylation समूहों के साथ सभी मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों की जगह. Glycans की संरचनात्मक काम permethylation के बिना संभव है, permethylation 17 संवेदनशीलता बढ़ जाती है.Levery और झोउ, आईटी एमएस पद्धति के संभावित लाभ के सभी समाजिक stru का पता लगाने सहित, संयुक्तबेहद संवेदनशील और कई समदाब रेखीय 7-9 मिश्रण के रूप में मौजूद glycosphingolipids के पहचान quantitation के लिए हस्ताक्षर नैदानिक आयनों, केवल 4 एमएस और एमएस 5 स्पेक्ट्रा में नमूदार है, का उपयोग ctures. सिद्धांत रूप में, हम करने के लिए हर मौजूदा glycolipid संरचना की पहचान करने में सक्षम मानक glycolipids, जो रासायनिक संश्लेषित किया जा सकता है की उपलब्धता लंबित है, हो सकता है.
इस विश्लेषण के महत्वपूर्ण कदम जैविक नमूनों से GSLs के वसूली दर हैं. जीएसएल का आमतौर पर 80 ग्राम RBL के रूप में 100 लाख ट्यूमर कोशिकाओं से बरामद किया जा सकता है. आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर में विखंडन के कई दौर के लिए पर्याप्त आणविक आयनों उत्पन्न, ट्यूमर GSLs के कम से कम 10 माइक्रोग्राम आवश्यक हैं. शुद्धि दौरान GSLs की कम उपज आयनों, जो आगे विखंडन के अधीन नहीं किया जा सकता है की कम बहुतायत के लिए नेतृत्व करेंगे. विश्लेषण की सफलता GSLs जो बरामद कर रहे हैं की मात्रा पर निर्भर करता है. आमतौर पर, अंतिम सान्द्रpermethylated GSLs की entration पहले एक नैनो electrospray स्रोत पर विश्लेषण किया जा रहा है 1 मिलीग्राम / एमएल मेथनॉल में भंग, पहुँचना चाहिए. एक पूरी तरह से एमएस n विश्लेषण के लिए सीमा एमएस 1 प्रोफाइल में विशिष्ट आयन की बहुतायत पर निर्भर है. एक ठेठ ई 7 आयन बहुतायत एक पूरी तरह से एमएस 5 विश्लेषण के लिए आवश्यक है. शुद्धि दौरान GSLs की कम उपज चरण के दौरान peracetylation नुकसान GSLs (जो phospholipids हटा), जब प्रति acetylated GSLs Florisil राल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ के लिए बाध्य किया जाना चाहिए, धोया, और बाद में eluted के कारण हो सकता है. प्रति acetylated GSLs के सिलिका जेल बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए, नमूने क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में दो बार करना चाहिए के माध्यम से बहने के बाद पुनः लोड.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DZ एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र और NIH अनुदान AI079232 द्वारा समर्थित है. एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र के हिस्से में NIH अनुदान CA16672 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
| Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
| Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
| Acetone | Fischer | A18P-4 | |
| Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
| DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
| Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
| Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
| Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
| DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
| Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
| Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
| Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
| Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
| Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
| Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
| Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
| Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
| Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
| Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
| Pyridine: | Sigma | 270407 | |
| Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
| Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
| Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
| Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
| Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
| 12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
| Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
| 16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
| Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
| Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
| Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
| Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
| Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
| Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
| Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
| Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
| Sonicator | Fischer | FS20 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
| MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
| Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |
References
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