En spesifikk og sensitiv metode for å få innsikt i uttrykket profilen glykosphingolipid antigener i immun organer og celler er beskrevet. Metoden utnytter ion felle massespektrometri tillater trinnvis fragmentering av glykosphingolipid molekyler for strukturell analyse i forhold til kjemisk syntetiserte standarder.
Glykosfingolipider (GSL er) tilhører glycoconjugate klasse av Biomacromolecules, som bærer strukturell informasjon for betydelige biologiske prosesser som embryoutvikling, signaltransduksjon, og immun reseptor anerkjennelse 1-2. De inneholder komplekse sukker molekyldeler i form av isomerer, og lipid molekyldeler med varianter, inkludert fettsyre acylkjedelengde, umettethet, og hydroksylering. Både karbohydrater og ceramid deler kan være grunnlag for biologisk betydning. For eksempel, tri-hexosylceramides inkluderer globotriaosylceramid (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) og isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), som har identiske molekylære masser men distinkte sukker bindinger av karbohydrat moiety, ansvarlig for helt andre biologiske funksjoner 3-4. I et annet eksempel har det blitt vist at modifikasjon av Ceramide delen av alfa-galactosylceramide, en potent agonist ligand for invarimaur NKT-celler, endringer sine cytokin sekresjon profiler og funksjon i dyremodeller av kreft og auto-immune sykdommer 5. Vanskeligheten med å utføre en strukturell analyse av isomerene i immun organer og celler tjene som en barriere for å bestemme mange biologiske funksjoner 6.
Her presenterer vi en visualisert versjon av en metode for relativt enkel, rask og følsom analyse av glykosphingolipid profiler i immunceller 7-9. Denne metoden er basert på utvinning og kjemisk modifisering (permethylation, se nedenfor Fig. 5A, ble alle OH-grupper av hexose erstattet av MeO etter permethylation reaksjon) av glykosfingolipider 10-15, etterfulgt av etterfølgende analyse ved hjelp av matrise-assistert laser desorpsjon / ionisering tid- of-flight massespektrometri (MALDI-TOF/MS) og ion felle massespektrometri. Denne metoden krever 50 millioner immunceller for en fullstendig analyse. Forsøkene kan gjennomføres innen en uke. Den relative overflod av de ulike glykosfingolipider kan være avgrenset ved sammenligning til syntetiske standarder. Denne metoden har en sensitivitet på måle 1% iGb3 blant Gb3 isomerer, når 2 fmol av totalt iGb3/Gb3 blandingen er tilstede 9.
Ion felle massespektrometri kan brukes til å analysere isomerene. For eksempel for å analysere tilstedeværelsen av globotriaosylceramid og isoglobtriaosylceramide i samme prøve, kan man bruke fragmentering av glykosphingolipid molekyler til strukturelt diskriminere mellom de to (se nedenfor Figur 5). Videre forbedrer kjemisk modifisering av sukker enheter (gjennom en permethylation reaksjon) ionisering og fragmentering effektivitet for høyere sensitivitet og spesifisitet, og øker stabiliteten av Sialic syrerester. Utvinningen og kjemisk modifisering av glykosfingolipider kan utføres i en klassisk sertifisert kjemisk hette, og massespektrometri kan utføres av kjerneanlegg med ion felle MS instrumenter.
Den glycome, et begrep brukt i analogi til genomet og proteom, refererer til alle saccharide strukturer til en organisme. Å fullt ut forstå de mangfoldige funksjoner glykosylering vil kreve en helhetlig tilnærming som inkluderer både funksjonelle og strukturelle glycomics studier. Begge er komplisert av den ikke-malen drevet natur glycan biosyntese, den resulterende kompleksiteten og mangfoldet av sukkerkjedene strukturer, hyppig involvering av aglycone struktur i modulerende sukkerkjedene ligand-reseptor interaksjoner på molekylært nivå, og den funksjonelle betydningen av lav overflod ligander.
Det er generelt akseptert at massespektrometri (MS) er en uunnværlig metode for strukturelle glycomics studier, spesielt for å identifisere og karakterisere lav overflod ligander. Å observere glykaner eller glycoconjugates som molekylære arter, vi ofte bruker en svært effektiv, lav energi ionisering metoden, som kalles electrospray ionisering (ESI). For mer Detfeilte karakterisering av glycan struktur, er det viktig å velge individuelle molekylære arter og bryte glykaner i mindre biter. Dette gjøres normalt ved kollisjon-indusert dissosiasjon, som innebærer aktivering av glykaner gjennom kollisjon med inerte gassmolekyler. Den økte energi induserer bindingen brekkasje, og systematisk analyse av de resulterende fragmenter gir informasjon om den molekylære struktur av glykan. Ofte kan "signatur" fragmenter bli generert som er diagnostisk for spesielle sukkerkjedene strukturelle trekk. Sammen med molekylvekt, kan disse fragmenter iblant være tilstrekkelig for å identifisere glykaner, men i det siste mye mer informasjon er nødvendig for å fullt karakterisere dem, spesielt hvis strukturen er romanen. Disse metodene inkluderer sukker sammensetning analyse, gasskromatografi massespektrometri analyse av delvis denaturert alditol acetates for trepunkt analyse, og bestemte glycosidase fordøyelsen 17.
<p class="Jove_content"> Som vist i det siste tiåret 18-19, flere runder med lav energi fragmentering, som kan effektivt utføres i et ione-felle massespektrometer (IT-MS), i stor grad forbedrer den informasjonen utbyttet fra glykan massespektralanalyse . Med fire eller fem runder fragmentering (som ikke kan gjøres med andre MS instrumenter), er det mulig å skille isomere glykaner som inneholder de samme sukker komponentene anordnet i ulike sukkerarter sammenhengene, selv når disse er til stede sammen i blandinger av komponenter med samme Molekylmassen (isobarer). For denne analysen, var glykaner derivatisert, erstatte alle gratis hydroksylgrupper med metylgrupper hjelp permethylation. Mens strukturelle overdragelse av glykaner er mulig uten permethylation, øker permethylation følsomheten 17.Levery og Zhou, har kombinert alle de potensielle fordelene ved IT-MS metode, herunder påvisning av isomere structures hjelp signatur diagnostiske ioner, observerbare bare i MS 4 og MS 5 spektra for den svært følsomme identifisering og kvantifisering av glykosfingolipider stede i form av flere isobariske blandinger 7-9. I teorien kan vi være i stand til å identifisere hver eksisterende glycolipid struktur, påvente av standard glykolipider, som kan være kjemisk syntetiserte.
De kritiske trinnene i denne analysen er at utvinningen av GSLs fra biologiske prøver. Vanligvis 80 ug GSL kan utvinnes fra 100000000 tumorceller som RBL. Å generere tilstrekkelig molekylære ioner for flere runder med fragmentering i ion-felle massespektrometre, er minst 10 mikrogram av tumor GSLs nødvendig. Lite utbytte av GSLs under rensingen vil føre til lav overflod av ioner, som ikke kunne bli utsatt for ytterligere fragmentering. Suksessen til analysen er avhengig av mengden av GSLs som blir gjenvunnet. Vanligvis, endelig konsentration av permethylated GSLs bør nå 1 mg / ml, oppløst i metanol, før de blir analysert på en nano-Elektrospray kilde. Grensen for en grundig MS n analyse er avhengig overflod av spesifikt ion i MS en profil. En typisk e 7 ion overflod er nødvendig for en grundig MS 5 analyse. Lite utbytte av GSLs under rensingen kan være forårsaket av tap av GSLs under peracetylation trinn (som fjerner fosfolipider), når per-acetylerte GSLs må bindes til Florisil harpiks kromatografikolonne, vasket, og deretter eluert. For å sikre bindingen av per-acetylerte GSLs til silikagel, må prøvene reloaded to ganger til kromatografikolonne etter strømme gjennom.
The authors have nothing to disclose.
DZ støttes av MD Anderson Cancer Center og NIH tilskudd AI079232. MD Anderson Cancer Center støttes delvis av NIH stipend CA16672.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
1,2 Dichloroethane | Sigma-Aldrich | 34872 | Carcinogenic |
Acetic acid | VMR | JT9524-0 | |
Acetic anhydride | Fluka | 45830 | |
Acetone | Fischer | A18P-4 | |
Chloroform | Fischer | C606-1 | Carcinogenic |
DEAE Sephadex A25 (Cl Form) | GE Healthcare Biosciences | AB 17—170-01 | 100 gram |
Decane (anhydrous): | Sigma-Aldrich | 457116 | 100 ml |
Dichloroacetic acid | Sigma | D54702 | Carcinogenic |
Dialysis cassette | Fischer(Pierce) | 66110 | Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml |
DMSO | Thermo Scientific | 20684 | |
Ethyl acetate | Fischer | UN1173 | |
Florisil | Fluka | 46384 | for packing chromatography column |
Hexanes | EMD | HX0290-6 | |
Iodomethane | Riedel de Haen, Germany | 03810 | stabilized with silver foil Carcinogenic |
Methanol | VWR/EMD | MXO475-1 | |
Neutral glycosphingolipid Qualmix | Matreya | 1505 | |
Monosialganglioside mixture | Matreya | 1508 | |
Disialoganglioside mixture | Matreya | 1509 | |
Lactosyl ceramide and sialosylderivatives | Matreya | 1510 | |
Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives | Matreya | 1511 | |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Pyridine: | Sigma | 270407 | |
Sodium Hydroxide: | BDH | 0292 | 500 gram |
Sodium methoxide | Sigma | 404367 | 0.5 M solution in methanol |
Toluene | J.T. Baker | 9351-03 | 4 L |
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Pasteur pipettes | Fischer | 13-678-6A | 9″” |
Fiber glass (glass wool) | Corning Incorporated | 3950 | Pyrex 9989 glass |
12×75 mm glass tubes | Fischer | 14-962-10B | |
Calibrated pipettes (100 microlitter) | VMR | 53432-921 | |
16×100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 | Fischer | 14-961-29 | With screw caps |
Caps for glass tubes | Kimble | 40566C | size/13-415 |
Merck TLC plates | Sigma | Z 29, 301-6 | |
Glass tank for TLC | Sigma | Z 12,619-5 | |
Drummond Microcaps | Drummond scientific company | 1-000-0100 | 10 μl, for loading of TLC samples |
Sunrise Microplate Absorbance Reader | Tecan | A-5082 | |
Whatman Chromatography Paper | Fischer | 05-716-3E | 18 cm x 34 cm For TLC Tank |
Orcinol ferric chloride spray reagent | Sigma | O7875 | For detecting glycosphingolipids on TLC plates |
Prevel Spray Unit | Sigma | Z 36,555-6 | |
Sonicator | Fischer | FS20 | |
Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
Speedvac | Savant | AS160 | With chemical trap for organic solvants |
MALDI TOF-TOF Mass spectrometer | Applied Biosystems | Proteomics 4700 | |
Ion Trap Mass spectrometer | Thermo | LTQ |