प्रोटोकॉल के एक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया है. आण्विक जीवविज्ञान 1. डिजाइन निर्माण प्रोटीन का निर्माण और कोडोन इंजीनियर कृत्रिम जीन दृश्यों डिजाइन करने के लिए जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. जीन संगीतकार सॉफ्टवेयर का उपयोग कहीं और 3 विस्तार से पेशकश की गई है. संरेखण दर्शक मॉड्यूल का उपयोग करें और प्रोटीन अनुक्रम संरेखण तुलना और प्रोटीन निर्माण को परिभाषित करने के लिए डिजाइन मॉड्यूल निर्माण. , यदि उपलब्ध है (चित्रा 2) प्रोटीन डाटा बैंक (पी डी बी) में homologs से प्राथमिक और 3 डी संरचनात्मक तत्वों दोनों को लक्ष्य अमीनो एसिड अनुक्रम संरेखित करें. प्राथमिक संरचना के संरक्षण और homologs की 3 डी संरचना पर आधारित नई टर्मिनी चुनकर संरचना निर्देशित निर्माण डिजाइन बनाने के लिए संरेखण जानकारी का उपयोग करें. डिजाइन डालने पीसीआर (iPCR) और वेक्टर पीसीआर (vPCR) amplimers (टर्मिनल प्राइमरों). जीन सी का प्रयोगomposer के प्रोटीन से डीएनए एल्गोरिथ्म, कोडोन इंजीनियर न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम में निर्माण एमिनो एसिड अनुक्रम बैक अनुवाद करते हैं. ई. में अभिव्यक्ति के लिए अनुक्रम अनुकूलन करने के लिए उचित कोडोन उपयोग तालिका (कट) का उपयोग करें कोलाई. वस्तुतः आसान शुद्धि के लिए अनुमति देता है एक एन टर्मिनल 6x हिस्टडीन टैग और Smt3/SUMO संलयन प्रोटीन को शामिल करने के लिए संशोधित pET28 वेक्टर में डालने क्लोन. डीएनए 2.0 और एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से आदेश प्राइमरों के साथ कृत्रिम जीन आदेश रखें. 2. पोलीमर्स अधूरा प्राइमर एक्सटेंशन (पाइप) क्लोनिंग प्राइमर और जीन तैयार 1 मिनट के लिए 1000 rpm पर प्राइमर युक्त विक्रेता की आपूर्ति की प्लेटें अपकेंद्रित्र. प्राइमर एकाग्रता 100 माइक्रोन तक लाने के लिए और 50 μl ते बफर जोड़ें. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे की थाली में विआयनीकृत (डी) पानी के साथ 10 माइक्रोन तक प्राइमरों पतला. 1 मिनट के लिए 1300 rpm पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में विक्रेता की आपूर्ति जीन अपकेंद्रित्र. <li> ते बफर का प्रयोग, 50 एनजी / μl के लिए प्रत्येक ट्यूब के डीएनए एकाग्रता लाने. 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में, प्रत्येक प्राइमर के dilutions 10 एनजी / μl के लिए बनाते हैं. जब उपयोग में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्राइमरों और जीन. सम्मिलित पीसीआर (iPCR) तैयार करें बर्फ पर Pfu मास्टर मिक्स की एक शीशी पिघलना, कमरे के तापमान पर जीन और प्राइमरों रखना. प्राइमर का एक सेट करने के लिए एक थाली नक्शा बताए कुओं बनाएँ और निर्माण. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में डि पानी के 13 μl जोड़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से बीच सुझावों को बदलने के लिए, यह सुनिश्चित करने थाली नक्शे के अनुसार 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए आगे के 5 μl और रिवर्स प्राइमर के 5 μl जोड़ें. अच्छी तरह से थाली के नक्शे के अनुसार इसकी उचित करने के लिए प्रत्येक पूर्ण लंबाई जीन की 2 μl जोड़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से बीच सुझावों को बदलने के लिए, यह सुनिश्चित करना हर अच्छी तरह से Pfu मास्टर मिश्रण के 25 μl जोड़ें. निम्नलिखित पीसीआर शर्तों का उपयोग प्रतिक्रियाओं साइकिल: 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट </ली> 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड 50 डिग्री सेल्सियस 45 सेकंड 68 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस ∞ 25 चक्र के लिए कदम बी.डी. दोहराएँ. एक नया 96 अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के लिए प्रत्येक iPCR प्रतिक्रिया के 10 μl स्थानांतरण. प्रत्येक नमूने के 6X लोड डाई के 3 μl जोड़ें. टुकड़ा प्रवर्धन की पुष्टि के लिए एक 100-500 बीपीएस डीएनए सीढ़ी के बगल में 110 वी में 1% TAE EtBr agarose जेल पर प्रत्येक नमूना अलग करें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर iPCR उत्पाद जब उपयोग में नहीं है (फ्रीज पिघलना जितना संभव से बचने). 3. वेक्टर पीसीआर (vPCR) तैयार करें तब्दील ई. की रात संस्कृति प्रारंभ प्लाज्मिड pET28 वेक्टर साथ कोलाई. 50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ 2 YT शोरबा के दो 5 मिलीलीटर ट्यूबों टीका लगाना. 220 rpm पर 37 पर रात भर संस्कृतियों ° प्रकार के बरतन में सी के लिए आगे बढ़ें. 15 मिनट के लिए 3000 rpm पर centrifuging द्वारा रातोंरात वृद्धि के बाद संस्कृतियों स्पिन. एक Qiagen Qia का प्रयोग करेंप्रस्तुत करने का स्पिन Miniprep किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार बैक्टीरिया छर्रों से pET28 वेक्टर निकालने के लिए. के सेटअप प्रतिबंध एंजाइम digestions pET28 प्लाज्मिड निकाला. PET28 वेक्टर की 20 μl के लिए 10X BamHI बफर के 2.2 μl और BamHI और HindIII की 1 μl जोड़ें. 37 पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया सेते डिग्री सेल्सियस एक जेल पर अलग पाचन उत्पाद. 2.2.10 कदम को देखें. जेल से वेक्टर बैंड कट और निर्माता के निर्देशों के अनुसार QIAquick जेल निकालना किट का उपयोग कर यह शुद्ध. एक NanoDrop का प्रयोग, डीएनए एकाग्रता यों. 10 एनजी / μl के लिए वेक्टर कटौती पतला. -20 डिग्री सेल्सियस जब उपयोग में नहीं है पर स्टोर. VPCR प्राइमरों तैयार. 1,300 rpm पर 1 मिनट के लिए IDT आपूर्ति oligonucliotides अपकेंद्रित्र. डि पानी के साथ 100 माइक्रोन के लिए एकाग्रता लाओ. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में दोनों आगे और रिवर्स प्राइमरों के 10 माइक्रोन कमजोर पड़ने को तैयार है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्राइमरों और प्राइमर dilutions कमरे के तापमान पर बर्फ और पिघलना टेम्पलेट और प्राइमरों पर Pfu मास्टर मिक्स गला लें. एक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली में सेटअप vPCR प्रतिक्रियाओं: एक 96 अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति में आगे और रिवर्स vPCR प्राइमरों दोनों के 60 μl और पच pET28 टेम्पलेट (μl / 10 एनजी) के 24 μl गठबंधन. एक 12 टिप multichannel विंदुक का प्रयोग, प्रत्येक थाली की अच्छी तरह से शेष से 12 प्राइमर के μl और टेम्पलेट मास्टर मिश्रण हस्तांतरण. इस किताब और थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में टेम्पलेट मास्टर मिश्रण के 12 μl में परिणाम चाहिए. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए डि पानी के 13 μl जोड़ें. प्रत्येक अच्छी तरह से Pfu मास्टर मिक्स के 25 μl जोड़ें. कदम 2.2.7 में इस्तेमाल पीसीआर स्थितियों के माध्यम से साइकिल प्रतिक्रियाओं. पूल एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में vPCR प्रतिक्रियाओं के सब. (पच pET28 वेक्टर की उम्मीद की लंबाई एक जेल पर जमा पीसीआर उत्पाद के 10 μl अलग करके टुकड़ा प्रवर्धन सत्यापित करेंलगभग 6 केबी) है. 2.2.10 कदम को देखें. प्लेटों के विलय की तैयारी. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट के प्रत्येक कुएं में vPCR उत्पाद की अशेष 3 μl. -20 पर स्टोर प्लेटें ° iPCR उत्पाद के साथ मर्ज तक सी. 4. IPCR और vPCR उत्पाद मर्ज पिघलना iPCR उत्पादों और पूर्व aliquoted vPCR 96 अच्छी तरह से कमरे के तापमान पर थाली विलय. मर्ज थाली के अपने संबंधित अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक iPCR उत्पाद के 3 μl जोड़ें. शीर्ष दस रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में थाली विलय रूपांतरण. विक्रेता आपूर्ति रासायनिक सक्षम कोशिकाओं की एक 50 μl ट्यूब में हर मर्ज की प्रतिक्रिया के 2 μl जोड़ें और निर्माता की आपूर्ति प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ना. परिवर्तन थाली से प्रत्येक निर्माण के लिए रात भर संस्कृतियों को तैयार है. एक गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में एक 25 मिलीलीटर बाँझ जलाशय से विभाज्य 5 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ). Steri का प्रयोगले तकनीक, प्रत्येक परिवर्तन थाली से एक अलग कॉलोनी लेने और गहरी अच्छी तरह से ब्लॉक का उचित अच्छी तरह से टीका लगाना. एक AIRPORE कवर के साथ ब्लॉक कवर. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 220 rpm पर ब्लॉक हिलाएँ. 4,000 rpm पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक centrifuging द्वारा गोली कोशिकाओं. तैरनेवाला डालो और एक कागज तौलिया के साथ सूखी ब्लॉक के शीर्ष थपथपाना. मिनी प्रस्तुत करने का निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक Qiagen 96 अच्छी तरह से निर्वात उपकरण का उपयोग कर. 5. सफलतापूर्वक क्लोन संरचनाओं के ग्लिसरॉल स्टॉक तैयारी सफलतापूर्वक निर्माता के निर्देशों के अनुसार BL21 (DE3) रासायनिक सक्षम कोशिकाओं में अनुक्रम पुष्टि डीएनए क्लोन बदलना. प्रत्येक निर्माण के लिए, 2 YT शोरबा का 1 मिलीलीटर (50 माइक्रोग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) में BL21 (DE3) परिवर्तन और टीका लगाना से एक अलग कॉलोनी उठाओ. 37 में 3-4 घंटे के लिए 220 rpm पर संस्कृतियों हिला डिग्री सेल्सियस एक 1.5 मिलीलीटर लेबलअद्वितीय निर्माण आइडेंटिफिकेशन नंबर, सेल तनाव, और तारीख के साथ टोपी ट्यूब पेंच. 50% ग्लिसरॉल के 500 μl और सेल संस्कृति के 500 μl जोड़ें और कई बार पलटना. तुरंत सूखी बर्फ पर या एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ग्लिसरॉल स्टॉक की दुकान. 6. अभिव्यक्ति परीक्षण सेल Buffe आर बफर धो क्षालन बफर 50 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 8.0 300 मिमी NaCl 10 मिमी imidazole 1% के बीच 20 2 मिमी 2 MgCl 0.1 मिलीग्राम / μl Benzonase 1 मिलीग्राम / एमएल Lysozyme 50 मिमी नाह 2 4 पीओ, पीएच 8.0 300 मिमी NaCl 20 मिमी imidazole 0.05% बीच 20 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 300 मिमी NaCl 250 मिमी imidazole 0.05% बीच 20 * जोड़ें Benzonase, लाइसोजाइम,तुरंत सेल से पहले और protease अवरोध. स्ट्रीक एक केनामाइसिन चयनात्मक अगर पर ग्लिसरॉल स्टॉक से नमूना और 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस एक हौसले से उगाया ई. के साथ 0.5% ग्लूकोज के साथ पूरक टीका लगाना 1.2 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन के साथ), एक 96 अच्छी तरह गोल नीचे ब्लॉक में एक गैर उत्प्रेरण पूर्व संस्कृति प्रारंभ कोली को अलग. रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 rpm पर मिलाते हुए आगे बढ़ें रातोंरात वृद्धि के बाद, Novagen ओवरनाइट एक्सप्रेस 1 प्रणाली (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) पूर्व संस्कृति के 40 μl के साथ साथ पूरक टीबी शोरबा के 1.2 मिलीलीटर (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) inoculating द्वारा प्रेरण संस्कृतियों शुरू. 220 rpm पर मिलाते हुए 48 घंटा के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर छोटे पैमाने पर प्रेरण संस्कृतियों आगे बढ़ें. 15 मिनट के लिए 4000 rpm पर centrifuging द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं, प्रसंस्करण करने से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए -20 पर तैरनेवाला और दुकान डिग्री सेल्सियस टपकना. 96 अच्छी तरह से ब्लॉक में 300 μl lysis बफर में सेल छर्रों resuspend. </lमैं> सख्ती कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए झटकों से यांत्रिक सेल द्वारा पीछा किया 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर lysis बफर में कोशिकाओं को सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 rpm पर 30 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कच्चे lysate स्पष्ट करें एक 96 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ट्रे (Qiagen) को स्पष्ट किया lysate (घुलनशील अंश) के 200 μl हस्तांतरण करने के लिए एक मल्टी चैनल विंदुक का प्रयोग करें. साथ ही एक नमूना है जिसमें प्रत्येक के लिए, 40 μl नी NTA चुंबकीय मोती (Qiagen) जोड़ें. धीरे 16 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक घुमाव पर थाली आंदोलन एक चुंबकीय पोस्ट प्लेट (Qiagen) पर थाली प्लेस और अपार घुलनशील अंश हटा दें. नी NTA मोती के किसी भी बाहर पिपेट नहीं ख्याल रखना. पोस्ट थाली से थाली निकालें और धीरे 200 μl धो बफर में मोती resuspended. पिपेट और नीचे 30 सेकंड के लिए और फिर बाद थाली पर वापस थाली जगह. धोने बफर निकालें और कदम 6.12 दोहराएँ. पोस्ट थाली से थाली निकालें और नी NTA टा बाध्य elute5 मिनट के लिए 50 μl क्षालन बफर के साथ धोने से rget प्रोटीन. चुंबकीय पोस्ट प्लेट को फ्लैट नीचे प्लेट लौटें और एक ताजा 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट को क्षालन हस्तांतरण. एक ताजा 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट को क्षालन के 20 μl स्थानांतरण और 1 μl ULP1 प्रोटीज के साथ प्रतिक्रिया. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार, एक LabChip 90 का उपयोग कर केशिका वैद्युतकणसंचलन द्वारा eluted और eluted + Ulp1 अंश का विश्लेषण. वैकल्पिक रूप से, अभिव्यक्ति के परीक्षण से सभी भिन्न एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है. 7. बड़े पैमाने पर किण्वन एक ग्लिसरॉल स्टॉक से एक परिमार्जन प्राप्त करने के लिए एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करें, 100 मिलीलीटर टीबी शोरबा (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन साथ) टीका लगाना और रात में हो जाना. 220 rpm और 37 डिग्री सेल्सियस पर मंथन रातोंरात वृद्धि के बाद, की 10 मिलीलीटर के साथ एक 2 एल चकित फ्लास्क में ईएमडी autoinduction समाधान (निर्माता प्रोटोकॉल देखें) (50 मिलीग्राम / एमएल केनामाइसिन के साथ) के साथ टीबी शोरबा का 1 एल inoculating द्वारा पूर्व संस्कृति का विस्तारपूर्व संस्कृति (1:100 कमजोर पड़ने). 37 में विस्तारित 1 एल संस्कृतियों हिला डिग्री सेल्सियस, 20 को मिलाते इनक्यूबेटर का तापमान बदल डिग्री सेल्सियस 0.6 (600 आयुध डिपो) की एक ऑप्टिकल घनत्व तक पहुँच जाता है. रातोंरात वृद्धि के बाद, अभिव्यक्ति के परीक्षण के लिए प्रत्येक निर्माण से एक प्रतिनिधि 10 मिलीलीटर विभाज्य ले. हार्वेस्ट सेल 15 मिनट के लिए 5000 rpm पर centrifugation द्वारा पेस्ट और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. -80 पर चस्पा रुक सेल डिग्री सेल्सियस प्रोटीन शुद्धि बफ़र: Lysis बफर एक (संतुलन) बफर बफर बी (क्षालन) कॉलम बफर नौकरशाही का आकार घटाने 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 200 मिमी NaCl 0.5% ग्लिसरॉल 0.02% CHAPS 10 मिमी imidazole 1 मिमी TCEP 50 मिमी Arginine 5 μl Benzonase 100 मीटरजी Lysozyme 3 protease अवरोध करनेवाला गोलियाँ (ईडीटीए मुक्त) 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 200 मिमी NaCl 10 मिमी imidazole 1 मिमी TCEP 50 मिमी Arginine 0.25% ग्लिसरॉल 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 200 मिमी NaCl 200 मिमी imidazole 1 मिमी TCEP 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 200 मिमी NaCl 1% ग्लिसरॉल 1 मिमी TCEP * तुरंत सेल से पहले प्रत्येक 150 मिलीलीटर नमूने के Benzonase, लाइसोजाइम, और protease अवरोध गोलियाँ जोड़ें. 8. सेल Lysis बफर के 2 एल करें; लाइसोजाइम, protease अवरोध गोलियाँ या Benzonase (प्रत्येक नमूना lysis बफर के 150 मिलीलीटर में अलग lysed जाएगा) जोड़ नहीं है. पिघलना और resuspend सेल एक 01:05 बड़े पैमाने पर lysis बफर में पेस्ट: मात्रा अनुपात सख्ती से 4 बजे 30 मिनट के लिए सरगर्मी डिग्री सेल्सियस से एक साफ रंग का उपयोग बीकर की तरफ से ढीला हिस्सा टूट गया. इस समय अवधि के दौरान नी और Dialy तैयारबहन बफ़र बर्फ पर, एक Misonix sonicator (3 मिनट के लिए 70% बिजली, 2 सेकंड पर / 1 सेकंड बंद दालों) और overheating रोकने के लिए धीरे ज़ुल्फ़ कंटेनर का उपयोग कोशिकाओं lyse. भविष्य के विश्लेषण के लिए कच्चे lysate के एक छोटे से (200 μl) विभाज्य सहेजें. 4 में 35 मिनट के लिए 18,000 XG पर centrifugation द्वारा कच्चे lysate डिग्री सेल्सियस को स्पष्ट तैरनेवाला इकट्ठा करने और भविष्य के विश्लेषण के लिए एक छोटी सी (200 μl) विभाज्य बचा. स्टोर गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर यह प्रोटीन घुलनशील अंश में lysed किया गया है की पुष्टि की है जब तक. 9. पूर्व रन प्रोटीन निर्माता सेटअप प्रोटीन निर्माता पर बदल गया और सॉफ्टवेयर को खोलने का साधन को प्रारंभ. एक बार initialized, नमूनों में से प्रत्येक के लिए गैन्ट्री की एक अलग लाइन पर एक 5.0 मिलीलीटर जीई हेल्थकेयर HisTrap एफएफ निकल chelate स्तंभ (नी स्तंभ) देते हैं. प्रत्येक स्तंभ के माध्यम से संतुलन बफर के 3-4 स्तंभ मात्रा (सीवी) चलाएँ. संतुलन और क्षालन बफर लाइनों प्रधानमंत्री. Equilibrएक बार स्तंभ के माध्यम से बफर एक aspirating द्वारा स्तंभों को खा लिया. 10. निकेल 1 (Ni1) कॉलम भंडारण बफर दूर करने के लिए 20 मिलीलीटर मिल्ली क्यू पानी के साथ प्रत्येक स्तंभ धो लें. 5 मिलीलीटर बफर बी और संतुलन के लिए 25 मिलीलीटर बफर एक चलाएँ. 2 मिलीग्राम / मिनट की दर से स्तंभों में solubilized प्रोटीन युक्त स्पष्ट lysate लोड तो बफर ए के साथ एक 15 मिलीलीटर धोने से पालन Buffers के साथ एक कदम ढाल में बाध्य प्रोटीन Elute सम्मान से पीछा कर अनुपात से ए और बी: 5 मिलीलीटर 95:5, 5 मिलीलीटर 60:40, 10 मिलीलीटर 0:100. अलग क्षालन अंश लीजिए. विश्लेषण: एसडीएस पृष्ठ से eluted भिन्न, कच्चे lysate, स्पष्ट lysate, और प्रवाह के माध्यम से. पूल भिन्न प्रोटीन युक्त और मोटे तौर पर मौजूद प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक 280 को मापने के लिए एक Nanodrop का उपयोग करें. 11. ULP1 विखंडन बाद में जेल के विश्लेषण के लिए Ni1 स्तंभ पूल के एक छोटे से विभाज्य (250 μl) रखें. बाकी लाओ10 मिलीग्राम और उनके-श्रीमती आत्मीयता टैग हटाने के लिए कुल प्रोटीन की 1 μl / 5 मिलीग्राम पर ubiquitin की तरह प्रोटीज 1 (ULP1) जोड़ने के लिए Ni1 पूल की. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक हलचल प्लेट पर एक 10 केडीए आणविक वजन कटौती (MWCO) में 4 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए बफर के 2 एल के खिलाफ Ni1 पूल + ULP1 Dialyze डायलिसिस के बाद, Ni1 पूल और Ni1 पूल + ULP1 ULP1 दरार सफल रहा तो यह निर्धारित करने के एसडीएस पृष्ठ चलाते हैं. 12. निकेल 2 (Ni2) कॉलम एक ही नी स्तंभ पर cleaved प्रोटीन लोड और 1 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह कम दर पर कदम 9.3 दोहराएँ. cleaved बंद टैग स्तंभ के लिए बाध्य होगा और tagless लक्ष्य प्रोटीन अब प्रवाह के माध्यम से होगा. एक ताजा कंटेनर में प्रवाह के माध्यम से ले लीजिए. 3 मिलीग्राम बफर के साथ नी स्तंभ धो एक सब उनकी टैग और nonspecifically बाध्य प्रोटीन elute लिए बफर बी के 5 मिलीलीटर द्वारा पीछा किया. अलग से एक अंश ले लीजिए. Ni2 के एसडीएस पृष्ठ धोने, प्रवाह के माध्यम से और Ni2 क्षालन भिन्न ULP1 दरार को सत्यापित करने के लिए और कहा कि भागो जनसंपर्कotein के माध्यम से प्रवाह में मौजूद है. मोटे तौर पर प्रोटीन की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए एक 280 को मापने के लिए एक Nanodrop का प्रयोग करें. 13. ध्यान दे Ni2 प्रवाह के माध्यम से ध्यान लगाओ (और प्रोटीन मौजूद है Ni2 क्षालन) एक Amicon अल्ट्रा 10 केडीए MWCO अपकेंद्रित्र ट्यूब के साथ 5 मिलीलीटर. 4 डिग्री सेल्सियस पर 4,000 rpm पर 10 मिनट के अंतराल में स्पिन झिल्ली के किनारे से अधिक ध्यान केंद्रित से प्रोटीन को रोकने के लिए प्रत्येक स्पिन के बीच एक विंदुक के साथ मिक्स. 14. आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) 0.5 मिलीग्राम / एक AKTApurifier प्रणाली (जीई हेल्थकेयर) पर मिनट की एक प्रवाह दर पर 200 मिली सेकंड के बफर के साथ equilibrating द्वारा एक Sephacryl एस -100 10/30 जीएल स्तंभ (जीई हेल्थकेयर) की स्थापना की. निर्माता के निर्देशों के अनुसार एसईसी स्तंभ पर इस्तेमाल के लिए 10 मिलीलीटर superloops तैयार. एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, superloops पर नमूने लोड और एसईसी चलाने लगते हैं. छोटी मात्रा fr एकत्रित जबकि 280 एनएम पर यूवी absorbance को ट्रेस मॉनिटरकार्रवाई. एसडीएस पृष्ठ के माध्यम से एसईसी भिन्न भागो. उच्चतम तीव्रता बैंड दिखा एसईसी भिन्न तरणताल. जमा एसईसी भिन्न ध्यान लगाओ. 13.1 कदम को देखें. 100 μl नमूने, -80 में तरल नाइट्रोजन और दुकान में फ्लैश फ्रीज डिग्री सेल्सियस में विभाज्य प्रोटीन रवे बनाने की प्रक्रिया 15. प्रोटीन Crystallization चुनाव के क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के 80 μl (पन्ना जैव) के साथ एक 96 अच्छी तरह से कॉम्पैक्ट जूनियर क्रिस्टलीकरण थाली के प्रत्येक जलाशय (पन्ना बायो) पूर्व भरें. 2-20 मिलीग्राम / बर्फ पर एमएल और स्टोर करने के लिए बफर आकार के साथ प्रोटीन पतला. 96 कुओं में से प्रत्येक में प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण स्क्रीन के 0.4 μl के 0.4 μl बांटना और क्रिस्टल स्पष्ट टेप सील (Manco) के साथ कवर किया. 16 पर थाली स्टोर डिग्री सेल्सियस एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अगले कुछ हफ्तों में समय – समय प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की जांच करते समय. 16. क्रिस्टल फसल काटने </ P> माँ शराब और इथाइलीन ग्लाइकॉल से एक cryoprotectant बनाएँ. लक्ष्य प्रोटीन क्रिस्टल के साथ अच्छी तरह से कवर करने स्पष्ट टेप काटें. एक खाली अच्छी तरह से करने के लिए, इसी crystallizing के हालत के 1.6 μl जोड़ने और इथाइलीन ग्लाइकॉल की 0.4 μl 20% इथाइलीन ग्लाइकॉल की एक अंतिम एकाग्रता उपज और 80% हालत crystallizing के साथ गठबंधन. नोट: ग्लिसरॉल, तेल, कम मेगावाट पॉलीथीन ग्लाइकॉल्स, और / या cryoprotectant के प्रतिशत में अलग: क्रिस्टल विवर्तन अनुकूलन करने के लिए इस तरह के रूप में विभिन्न cryoprotectants कोशिश. ढक्कन के साथ तरल नाइट्रोजन और कवर से भरा एक देवर में एक ए एल एस शैली पक शांत कटाई से पहले. एक चुंबकीय क्रिस्टल छड़ी (हैम्पटन अनुसंधान) और अच्छी तरह समाधान से सीधे स्कूप पर क्रिस्टल का आकार मिलान भीतरी व्यास के साथ एक CryoLoop रखकर क्रिस्टल हार्वेस्ट. तुरंत ग फ्रीज फ़्लैश करने के लिए ए एल एस शैली पक में cryoprotectant तो डूब में काटा क्रिस्टल के साथ CryoLoop डुबकीrystal. क्रिस्टल की एक वांछित संख्या के लिए दोहराएँ. 17. क्रिस्टल स्क्रीनिंग / डाटा संग्रह एक बार कटाई ए एल एस पक पर चुंबकीय क्रायो पक ढक्कन जगह के लिए एक पक की छड़ी का उपयोग पूरा हो गया है. तुला चिमटे से, पक उल्टा फ्लिप. एक Rigaku अभिनेता देवर को पक स्थानांतरण, पक पर एक पक ढकेलनेवाला पेंच, और ऊपर का सामना पिन के साथ देवर में इसे छोड़ने के ढक्कन बंद मुक्का. JDirector सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, निम्नलिखित मानकों के तहत स्क्रीन प्रत्येक क्रिस्टल: 0.5 डिग्री करने के लिए सेट किरण भट्ठा, 50 मिमी के लिए सेट डिटेक्टर दूरी, 70 डिग्री करने के लिए छवि कदम, और जोखिम लंबाई 30 सेकंड के लिए निर्धारित किया है. आप सबसे अच्छा क्रिस्टल और रणनीति डेटा संग्रह के लिए है निर्धारित करने के क्या JDirector के साथ गोली मार दी परीक्षण छवियों पर Mosflm चलाएँ. Mosflm से अपने परिणाम के आधार पर एक पूर्ण डाटासेट लीजिए. 18. डाटा प्रोसेसिंग / संरचना निर्धारण डाटासेट प्रक्रिया को XDS / XScale 4 चलाएँ. CCP4 सूट सॉफ्टवेयर खोलें. जब उपलब्ध है, एक उच्च अनुरूपता खोज मॉडल का उपयोग कर एक आणविक प्रतिस्थापन समाधान गणना करने के लिए Phaser 5 चलाएँ. इस मामले में हम एक खोज मॉडल के रूप में 6 PDBID 3CW4 इस्तेमाल किया. डाटासेट में एकत्र मनाया प्रतिबिंब के खिलाफ अपनी आणविक मॉडल को निखारने के लिए Refmac 7 चलाएँ. अंतिम संकल्प उच्चतम खोल के बंद आधारित है और निम्नलिखित मानकों के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए: आर कारक> 50%, मैं / सिग्मा> 2, और पूर्णता> 90%. आणविक ग्राफिक्स सॉफ्टवेयर कूट 8 के साथ एक 3 आयामी इलेक्ट्रॉन घनत्व मॉडल बनाएँ. पी डी बी में संरचना जमा करने से पहले संरचना की है कि गुणवत्ता को सत्यापित करने MolProbity 9 सॉफ्टवेयर के साथ यह मान्य बयान के लिए उपयुक्त है.