パーキンソン病の分野におけるミトコンドリアの表現型を監視するための主要ヒト線維芽細胞の使用

Summary

パーキンソン病の原因遺伝子に変異を有する患者からの線維芽細胞は、簡単にアクセスを表す

Abstract

パーキンソン病（PD）は、第二の最も一般的な運動障害であると60 ¹歳以上の人々の1％に影響を与えます。高齢化が最も重要な危険因子であるため、PDの例は、次の数十年の間に²増加します。病的なタンパク質の折り畳みや障害タンパク質分解経路の隣に、ミトコンドリアの機能と形態の変化は、PD ^3-11の神経変性のさらなる特質として指摘された。

パーキンソン症候群の分子経路を分析するためのin vitroモデルとしてマウスとヒト癌細胞の研究の年後に、ex vivoでのモデルとして、患者と適切なコントロールから、ヒト線維芽細胞の使用は、潜在的な注意事項が考慮される場合には、貴重な研究ツールとなっています。不死ではなく、人工細胞モデル以外、疾患関連変異を有する患者からの主な線維芽細胞は明らかに重要な病理学的特徴を反映しているOfは、ヒトの疾患。

ここでは、皮膚生検を取って培養ヒト線維芽細胞とミトコンドリアの表現型を定義するために不可欠な顕微鏡技術の詳細なプロトコルを使用しての手続きを描く。これらは、ミトコンドリアの機能とダイナミクスに関連しているPDに関連付けられているさまざまな機能を調査するために使用されていました。 エクスビボが 、ミトコンドリア、リソソーム経路を介して、それらの機能、形態、リソソーム（オルガネラ分解する機能不全のミトコンドリア）と劣化と共局在化の観点から分析することができます。これらの表現型は、PDの初期の兆候を識別するための非常に関連しており、ヒトの疾患遺伝子キャリアの臨床運動症状に先行するかもしれません。したがって、ここで紹介するアッセイは、神経変性の病理学的特徴を識別し、PDに新たな治療戦略を定義するのに役立つ貴重なツールとして利用することができる。

Protocol

1。皮膚生検およびヒトの線維芽細胞の培養

1. 皮膚生検では、経験豊富な医師が撮影しなければならない。手順は、無菌条件下で行われ、局所麻酔を必要とします。生検のために使用される代表的なサイトは、上腕、肩や腰の内側にあります。
2. あなたは、培養ヒト線維芽細胞に十分な組織を得るためにパンチ生検によって4x4mmまたは6x6mm径の標本を取ることができます。
3. 2月4日T25フラスコにそれらを分離するために無菌条件下に等しい小さな断片に生検皮膚を切り取ります。すべてのフラスコは、表皮の2-3部分を含んでいる必要があります。培養培地は、15％FCS、1.1％ピルビン酸ナトリウムとロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640培地で1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含んでいます。
4. 37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。予想伝搬時間第一繊維芽細胞は、表皮のサンプルから成長するまで1〜2週間です。成長の問題が発生した場合は、線維芽細胞増殖FAを利用することができます細胞の増殖を高めるためにコレクタ（5-10 ng / mlとFGF2）。
5. 50〜70％コンフルエントの細胞に到達すると、初代ヒト線維芽細胞を凍結することができる。 50〜70％コンフルエントになるまでの時間に達すると、細胞株によって異なる。 90パーセントのFCSプラス10％ジメチルスルホキシド（DMSO）に線維芽細胞を凍結。

2。ライブセルイメージング顕微鏡のためのヒト線維芽細胞の調製

老化関連変更が複数回の継代後の細胞のプロパティを変更することができるように一般的には、ヒト線維芽細胞を用いた実験は、10以下の通路で行われるべきである。疑義のある場合は、β-ガラクトシダーゼアッセイは、それぞれの細胞で老化プロセスの誘導を評価するために用いることができる。一般的に、高齢者の線維芽細胞（上記参照）を使用しないでください。さらに、いくつかの細胞株を比較するために、各細胞株の同じ通路番号で動作します。健常対照群と比較して、異なる遺伝的に均質な患者の比較をお勧めします。しかし、時には特定の変異を有する患者はまれで、これは一定の継代数と異なる制御線でたった一人の患者から皮膚生検が含まれなければならないことを意味することができますすることができます - ここにそれが含まれているすべての行の同じ通路を確保することが不可欠です。 50〜70％コンフルエントの細胞に達しますが、実験が計画されていない場合は、線維芽細胞を凍結保存してください。

1. 実験の最初の日に、PBSで一度添付線維芽細胞を洗う。その後、タンパク質分解酵素のDNase（ すなわち ACCUMAX）の細胞剥離液を用いてフラスコの底からそれらを解放します。
2. 4室カバーガラス（ウェル当たり1.8 cm ^2の培養面積）の各ウェルにあなたの細胞や種子50,000〜70,000細胞をカウントする。したがって、8室のcoverglasため、細胞数または少し少なめの半分は（よく当たり0.8 cm ^2の培養面積）が適切です。それは本当のシングルセル解析を行うことなく、少数の細胞種にとって重要である。チャンバーのための特定のコーティングないisが必要としていました。
3. 24から48時間後、ライブセルイメージング実験を行うことができます。ライブセルイメージング顕微鏡は温度とCO ₂レベルを制御するインキュベーターが装備されていることを確認します。画像取り込み、37℃の雰囲気中にCおよび5％CO _2が維持されるべき_である。
4. 各ライブセルイメージング測定は少なくとも3つの独立した実験で行うべきである。合計では、細胞株ごとに50セルの最小値を画像化されるべきである。ライブセルイメージングの実験だけでなく、オフラインでの分析は、収集公平なデータを保証するために、盲目の条件下​​で行わなければならない。

3。ヒト線維芽細胞を生体内でミトコンドリア機能の測定

ミトコンドリア膜電位（MMP）に依存する染料を介したミトコンドリア機能の従来の測定では、蛍光活性化細胞選別（FACS）が主要な方法です。ヒト線維芽細胞の場合、細胞autofluoreでscenceは頻繁に観察されており、実際の染色信号との干渉による偽陽性の結果を引き起こす可能性があります。自家蛍光は、典型的には線維芽細胞のより高い継代数でより顕著になります。したがって、我々はライブセルイメージング顕微鏡によるヒト線維芽細胞のミトコンドリアの機能を評価することを好む。

1. 播種後24〜48時間は、RPMI培地中のMMP-依存染料tetramethylrodamineエチルエステル（TMRE）の50 nMで線維芽細胞を培養する。これは否定的に画質に影響を与えることができるので、これRPMI培地は、フェノールレッドを欠いている必要があります。ヘキスト染色の1.6μmの核を可視化するために追加する必要があります。
2. 37℃、5％CO ₂で15分間、光から保護し、準備染色液で細胞をインキュベートします。
3. RPMI培地（フェノールレッドなし）染色液を交換してください。洗浄工程と直ちに画像セルせずに作業を進める。 63X倍率と用いた共焦点レーザー走査顕微鏡技術（あるいは、蛍光顕微鏡を使用細胞の単層を定義するための余線分技術）。 37℃、5％のイメージングプロセスの間に細胞にCO _2を適用します。
4. イメージング線維芽細胞が、TMRE染色は迅速に漂白することができますように蛍光灯の場合、露出時間に最大限の注意を払うとき。 200〜300ミリ秒の間に適切な露光時間を定義し、この間隔を超えないようにしてください。設定は細胞株との間で異なる場合は、1つは強度に基づいて比較することができないでしょうとして標準化された設定の下での画像取得は、非常に重要です。
5. 画像化された細胞の周りに定義されている半径は光露光後漂白されたように、十分に遠くphotobleachedセクションから次の視野を保つ。
6. オフライン分析はImageJのソフトウェア（;国立衛生研究所、米国ウェインRasband）を使用して実行されます。
7. 選択ツールを使用して興味のあるセルを選択します。
8. 8ビット（画像<タイプ<8ビット）に画像を変換。
9. 非特異的なノイズbを減らすyは "輪郭以外をぼかす"機能（プロセス<ノイズ<斑点除去）を使用。
10. 条件（画像<ルックアップテーブル<火） - "火ルックアップテーブル"を選択します。
11. "オーバー/アンダー"関数へのしきい値関数で切り替えると（イメージ<調整<しきい値）がしきい値を調整します。
12. あなたに検出可能な各ミトコンドリア粒子（分析<分析粒子）の平均グレー値を与えるだろう "粒子を分析する"オプションを選択します。 Excelスプレッドシートとして指定された結果リストを保存します。
13. オープンしている結果は、Excelプログラムでファイルおよびミトコンドリア構造（与えられたエクセル結果リストの "平均"として示される）の平均グレイ値の平均を計算します。
14. サーフェスプロットを作成するには、 "3D"のプラグインセクションでプラグイン "インタラクティブ3Dサーフェスプロット"を選択してください。ここでは、さらに別の表示オプションを使用して、プロットを調整することができます。 "スペクトルLUT"に "元の色"を変更すると、適切なプロットに対する強度のスケールバーを提供します。
15. 代わりにライブセルイメージング、MMP-独立染料MitotrackerグリーンFMの組み合わせとCM-H ₂ XRosを使用することができ、MMP-依存染料Mitotrackerを介してヒト線維芽細胞のミトコンドリア機能を解析するためTMREを使用する。繰り返しになりますが、ヒト線維芽細胞のセル·イメージング顕微鏡が好ましい住んでいますが、一般的には、この代替はまた、細胞¹²の他の種類のFACS分析を使用して使用されています。プロトコルセクション5 "ヒト線維芽細胞を生体内でmitochondrio-リソソーム局在の測定"の手順3-7、ヒト線維芽細胞のミトコンドリア機能を測定するために、この代替方法を使用する場合は適用されるべきである。それと、MitotrackerグリーンのFMおよびMitoTracker CM-H ₂ XRosためのミトコンドリアが正から両方の信号のオーバーレイは、計算され、すべてのミトコンドリアに存在する比率などの機能ミトコンドリアの量を示しています。

4。ヒト線維芽細胞を生体内でミトコンドリアの形態の測定

1. 24から48hrは播種後、RPMI培地中で200nMのMitotrackerグリーンFM（フェノールレッドなし）でインキュベートした細胞は37℃で15分間、光から保護℃、5％CO _2。ヘキスト染色の1.6μmの核を強調するために使用されるべきである。 MitotrackerグリーンFMはすべてミトコンドリアの構造が存在汚れMMP - 独立した染料です。
2. 優しくPBSで一回細胞を洗浄する。
3. 細胞と直ちに画像セルに新鮮なRPMI培地（フェノールレッドを含まない）を追加します。 63X倍率および細胞の単層を定義するために、共焦点レーザー走査顕微鏡法（余線分技術を使用して代わりに蛍光顕微鏡）を使用します。
4. オフライン分析はImageJの本ソフトウェアの使用によって取り出される。
5. 選択ツールを使用して興味のあるセルを選択します。
6. 8ビット（画像<タイプ<8ビット）に画像を変換。
7. "輪郭以外をぼかす"機能（プロセス<ノイズ<斑点除去）を使用して、非特異的ノイズを低減します。
8. ミトコンドリアを強調するために、畳み込みフィルタを使用drial構造（<フィルタ<コンボリューション処理）。
9. 信号対雑音比が適切であるように、しきい値を調整します（イメージ<調整<しきい値）。
10. "粒子を分析する"オプションを使用することで、ミトコンドリアの構造の自動識別は、（分析<分析粒子）選択されたピクセルサイズに基づいて開始されます。いくつかのミトコンドリアのパラメータは、その後そのような面積、周囲長、マイナーとメジャー軸または円形のように計算されます。これらの測定は、（<セット測定を解析）個別に設定することができます。 Excelスプレッドシートとして指定された結果リストを保存します。
11. Excelプログラムで結果ファイルを開きます。このようなパラメータを使用すると、ミトコンドリアの形態の分析を行うことができる。これはミトコンドリアネットワークの分岐の程度を示すフォームファクタの定義は含まれています[式：（周囲^2）/（4 * PI（）*面積）]と同様にアスペクト比がミトコンドリア（式の長さを定義する：主要軸/短軸）。

5。ヒト線維芽細胞を生体内でMitochondrio-リソソーム局在の測定

1. 播種後24〜48時間、37℃で15分間、光から保護RPMI培地中で200nMのMitotrackerグリーンのFMおよび100nM LyostrackerレッドDND-99においてインキュベート細胞（フェノールレッドを含まない）℃および5％CO _2。ヘキスト染色の1.6μmの核を強調するために使用される。
2. 新鮮RMPI培地（フェノールレッドを含まない）を100nM LyostrackerレッドDND-99を含有する培地を交換してください。この色素は、全体のイメージングセッション中に存在する必要があります。潜伏期間の後、細胞を洗浄しないでください。すぐに画像のセルを。 63X倍率および細胞の単層を定義するために、共焦点技術（あるいは、余線分技術）を使用します。
3. オフライン分析はImageJの本ソフトウェアの使用によって取り出される。
4. あなたは共局在状態の観点から分析したいと思います2、それぞれの画像を開きます。
5. 8ビット（画像<タイプ<8ビット）に画像を変換。 両方のイメージで "輪郭以外をぼかす"機能（プロセスが<ノイズ<斑点除去）を使用することにより非特異的ノイズを低減します。
6. プラグインは、各チャンネルの入力値を与えると、ピアソンの係数を計算する共局在解析のツールと​​して、 "JACoP"を選択し、係数とManders '係数（プラグイン<JACoP）と重なる。

6。代表的な結果

ヒト線維芽細胞を生体内でミトコンドリア機能はライブセルイメージング技術によって評価することができます。機能アッセイについては、TMRE蛍光信号は、ミトコンドリア膜電位（MMP）と相関している。通常のMMPの条件下では、TMREの ​​蛍光が減少したMMP（ 図1A、下段）によって特徴付けられる病理学的条件下より（ 図1A、上段）大幅に高くなっています。この蛍光強度は、すべてミトコンドリアの構造の平均グレイ値の平均を計算することによって測定されます（ 図1A、右側）の実例を可能にします。

ヒト線維芽細胞のミトコンドリア機能の評価に続いて、ライブセルイメージング顕微鏡ミトコンドリア形態の異なるパラメータを定義するために使用することができます。 MitotrackerグリーンFM染料ミトコンドリアの構造を使用することにより、それぞれのMMP（ 図2）の独立した可視化される。これは分析に存在するすべてのミトコンドリアの構造を含めることを確保することが重要である。ミトコンドリアの形態パラメータを評価することができるここでしかとしてImageJのソフトウェアを使用して、形態が（ 図2、 "バイナリ"）、バイナリの数値に基づいて分析されます。フォームファクタと同様にアスペクト比の点でミトコンドリア形態解析のための例は、最近^6,1を公表^した3。ヒト線維芽細胞を生体内で測定することができるもう一つの重要な特徴は、ミトコンドリアの構造物の劣化である。この進行中の最初のステップはライブセルイメージング顕微鏡mitochondrio-リソソーム局在することによって評価することができる。特定の病理学的状態リソソーム（ 図3A）とミトコンドリアの増加局在における結果。再び、MitotrackerグリーンFMは、それぞれ独立したMMPのミトコンドリアの構造を染色するために使用されます。また、LysotrackerレッドDND-99で染色すると、リソソームの構造を可視化することができます。これは、洗浄工程の可視化のために低すぎるとなる信号を減らすようLysotracker赤い色素は、イメージングプロセスの間に存在していることが重要です。共局在は、緑（グリーンMitotracker FM）と赤（LysotrackerレッドDND-99）染色（白矢印、 図3A）の重なりに起因する明確な黄色の蛍光シグナルによって表され、ピアソンCOEの計算によって決定されるfficient（ 図3B）。

一般的に、ImageJのソフトウェアとオフライン分析のために、それは特定の関心領域（ROI）の定義を回避することができるように、画像ごとに1セルを視覚化しておくと便利です。

図1：ライブセルイメージング技術によって、ヒト線維芽細胞を生体内でミトコンドリア膜電位（MMP）を示すTMRE蛍光シグナルの測定。 （A）はTMREは、その蛍光強度のMMPと相関蛍光MMP依存染料です。 Hoechst色素は核（青）を染色するために使用されていました。通常のMMPの条件の下で（上段）、TMRE蛍光が減少したMMP（下段）によって特徴付けられる病理学的条件下よりも大幅に高くなっています。蛍光強度がさらに示されています強度サーフェスプロットとして。スケールバーは10μmを示す。 （B）は、典型的な線維芽細胞の統計的分析は、（a）に示す。病理学的条件下では、ミトコンドリアの減少TMRE蛍光は通常のMMPの条件に比べて測定されます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2：ライブセルイメージング技術によって、ヒト線維芽細胞を生体内でミトコンドリアの形態の測定。 MitotrackerグリーンFM（緑）がミトコンドリアの構造を可視化するために使用され、そのためにそれは、MMPとは無関係です。 Hoechst色素は核（青）を染色するために使用されていました。 ImageJのソフトウェアを用いて、形態がバイナリの数値で分析することができます。スケールバーは10μmを示す。 ]をクリックここに大きな図を表示します。

図3ライブセルイメージング技術によって、ヒト線維芽細胞を生体内でリソソームによるミトコンドリアの局在化の測定。 （A）はMitotrackerグリーンFM（緑）がミトコンドリアの構造を染色するために使用され、LyostrackerレッドDND-99（赤）がリソソーム構造を可視化する。 Hoechst色素は核（青）を染色するために使用されていました。病理学的条件の下で成功した共局在はLysotrackerの赤およびMitoTracker Green染色（白矢印）のオーバーラップによる黄色信号によって示されます。スケールバーは10μmを示す。 （B）は、典型的な線維芽細胞の統計的分析は、（a）に示す。高架ピアソン係数値でmitochondrio-リソソーム局在結果の上位程度。/ 4228/4228fig3large.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ex vivoでのモデルのような患者の皮膚の線維芽細胞は、疾患関連遺伝子の欠陥を特徴付けるための重要なツールを表します。また、皮膚由来の線維芽細胞は、簡単にアクセスすることができますし、培養時に拡張することができます。彼らは内因性疾患の原因となる遺伝子が、罹患者の全体の遺伝的背景だけでなく、含まれているとして、そのために、PD関連遺伝子変異を有する患者から得られた初代培養細胞は、腫瘍細胞株の使用上好ましい。また、線維芽細胞が神経変性中にミトコンドリア機能障害の重要な病理学的特徴を反映していることが示されている。このプロトコールに記載の実験は、機能、形態と同様にライブセルイメージング技術を介してリソソームとミトコンドリアの局在を評価するなど、ミトコンドリアの表現型を研究するために特に有用である。それと、病気の主な特徴、すなわち、ミトコンドリア機能障害およびその後のdegradこれらの非機能的な細胞小器官のationは^、13、可視化し、適切に^6を分析することができます。ミトコンドリア機能と形態の変化は、多くの場合、疾患の病理学の最初のステップです。例えば、ミトコンドリアネットワークの増加断片化が強化されたオートファジーとmitophagicプロセス^6,12の前提条件とすることができる。したがって、リソソームによるミトコンドリアの局在は、ミトコンドリアの分解（マイトファジー^）6を評価するために役立つことがあります。この局在の欠如だけでなく、リソソームによるミトコンドリアの蓄積は、リソソーム分解経路の欠陥を反映したものであり、変調オートファジーフラックス⁶によって検証されなければなりませんでした。このコンテキストでは、ImageJのソフトウェアがハーフ自動非偏っ分析機能によって検証されたデータセットを生成するための重要なツールを表します。

より多くの疾患関連モデルにヒト線維芽細胞の使用を拡張する追加オプションは、潜在的なgeneratです病気のプロセス¹⁴のメインターゲットである異なる種類の細胞に分化させることができる人工多能性幹（iPS）細胞のイオン。パーキンソン病の場合には、ドーパミン作動性ニューロンへの線維芽細胞の分化には ​​、この細胞モデルこの神経変性疾患^15,16における将来の研究のための有望なツールとなっています。重要なのは、ここに記載のアッセイプロトコルのすべてが簡単にドーパミン神経細胞内のミトコンドリアの変化を調査するための実験装置に変換することができます。もちろん、さらにニューロン特異ライブセルイメージング実験はあまりにも、適用することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.