A utilização de recursos primários fibroblastos humanos de Monitoramento Fenótipos mitocondriais no Campo da Doença de Parkinson

Summary

Fibroblastos de pacientes portadores de mutações no causadores de doenças de Parkinson genes representam um facilmente acessível

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é o distúrbio de movimento segundo mais comum e afeta 1% das pessoas com idade superior a 60 ^1. Porque o envelhecimento é o fator de risco mais importante, os casos de PD irá aumentar durante as próximas décadas ^2. Ao lado de dobramento de proteínas patológica e vias de degradação de proteínas com deficiência, alterações da função mitocondrial e morfologia foram apontados como característica adicional de neurodegeneração na DP ^3-11.

Depois de anos de pesquisa em células de cancro de murídeo e humanos como em modelos in vitro, para dissecar vias moleculares do parkinsonismo, a utilização de fibroblastos humanos a partir de doentes e os controlos adequados como modelos ex vivo tornou-se uma ferramenta de investigação valiosa, se ressalvas potenciais são considerados. Outros que imortalizaram, modelos de células bastante artificial, fibroblastos primários de pacientes portadores de doença mutações associadas aparentemente refletem importantes características patológicas of a doença humana.

Aqui nós delinear o processo de realização das biópsias da pele, f ibroblastos humanos de cultura e meio de protocolos detalhados para técnicas microscópicas essenciais para definir fenótipos mitocondriais. Estas foram utilizadas para investigar as diferentes características associadas à DP que são relevantes para a função mitocondrial e dinâmica. Ex vivo, as mitocôndrias podem ser analisados ​​em termos da sua função, morfologia, colocalização com lisossomas (os organelos degradante mitocôndrias disfuncionais) e através da via de degradação lisossómica . Estes fenótipos são muito relevantes para a identificação de sinais precoces de PD e pode preceder os sintomas motores da doença clínica em humanos do gene-transportadoras. Assim, os ensaios aqui apresentados podem ser utilizados como ferramentas valiosas para identificar as características patológicas da neurodegeneração e ajudar a definir novas estratégias terapêuticas na doença de Parkinson.

Protocol

1. A biópsia de pele e cultura de fibroblastos humanos

1. A biópsia de pele tem de ser tomada por um médico experiente. O procedimento é realizado sob condições estéreis e requer anestesia local. Sítios típicos usados ​​para a biópsia é o lado interno da parte superior do braço, ombro ou costas.
2. Você pode tirar amostras de diâmetro 4x4mm ou 6x6mm por biópsia para obter tecido suficiente para fibroblastos humanos cultura.
3. Cortar a biópsia da pele em pequenos pedaços iguais em condições estéreis para separá-los em frascos T25 2-4. Cada frasco deve conter 2-3 pedaços de epiderme. O meio de cultura contém FCS a 15%, piruvato de sódio a 1,1% e 1% de penicilina / estreptomicina no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
4. Incubar as células a 37 ° C e 5% CO _2. O tempo de propagação esperado até fibroblastos primeiro crescer para fora da amostra da epiderme é de 1-2 semanas. Se os problemas de crescimento são encontrados, você pode fazer uso de fa de crescimento de fibroblastosctor (5-10 ng / ml FGF2), para aumentar o crescimento das células.
5. Uma vez que uma célula de confluência de 50-70% é alcançado, os fibroblastos humanos primários pode ser congelada. O tempo até a confluência de 50-70% é alcançado, difere entre as linhagens de células. Congelar os fibroblastos em 90% de FCS a 10%, mais de sulfóxido de dimetilo (DMSO).

2. Preparação de fibroblastos humanos para Microscopia de células vivas de imagem

Em geral, as experiências com fibroblastos humanos deve ser realizada com menos de 10 passagens como senescência associadas alterações podem alterar as propriedades das células após múltiplas passagens. Em caso de dúvida, a beta-galactosidase ensaios podem ser usados ​​para avaliar a indução de processos de envelhecimento nas respectivas células. Geralmente, não usar fibroblastos envelhecidos (ver acima). Além disso, para comparar diversas linhagens, trabalhar com o número mesma passagem de cada linha de células. Comparação de diferentes pacientes geneticamente homogéneos em comparação com controlos saudáveis ​​é recomendada. No entanto, como algumas vezespacientes portadores de mutações específicas podem ser raros, isso pode significar que as biópsias de pele de apenas um paciente com um número de certa passagem e linhas de controle diferentes têm de ser incluídos - aqui é essencial para garantir o número mesma passagem de todas as linhas incluídas. Se uma célula de confluência de 50-70%, mas não é atingida experiência projectada, fibroblastos devem ser congeladas.

1. No primeiro dia do experimento, os fibroblastos em anexo lavar uma vez com PBS. Depois libertá-los a partir do frasco de fundo por meio de uma solução desprendimento de células de enzimas proteolíticas (por exemplo, ADNase ACCUMAX).
2. Contar as células e as sementes de 50,000-70,000 células em cada poço de uma lamela 4 câmaras (1,8 centímetros área de cultivo ² por poço). Por conseguinte, para os coverglas 8-câmara, a metade do número de células ou um pouco menos apropriado (0,8 centímetros área de cultivo ² por poço). É importante para as sementes, em vez de um pequeno número de células para realizar a análise de uma única célula real. Nenhum revestimento específico para as câmaras is necessário.
3. Após 24-48 horas, a experiência de imagem ao vivo das células pode ser executada. Certifique-se de que o microscópio de imagem ao vivo célula está equipada com uma incubadora que controla a temperatura e os níveis de CO _2. Durante a aquisição de imagem, numa atmosfera de 37 ° C e 5% CO ₂ deve ser mantida.
4. Cada medição de imagens ao vivo de células deve ser efectuada em, pelo menos, três experiências independentes. No total, a um mínimo de 50 células por linha de células deve ser trabalhada. As experiências com células vivas de imagem, bem como as análises off-line tem que ser realizada sob condições cegas para garantir dados imparciais recolha.

3. Medição da função mitocondrial em Viver fibroblastos humanos

Para a medição convencional da função mitocondrial via potencial de membrana mitocondrial (MMP) dependentes de corantes, classificação de células activadas fluorescentes (FACS) é o método primário. No caso de fibroblastos humanos, celular autofluorescence é frequentemente observada e pode causar resultados falsos positivos por interferência com o sinal de coloração real. Autofluorescência tipicamente se torna mais pronunciada com um maior número de passagem de fibroblastos. Portanto, prefere-se avaliar a função mitocôndrica de fibroblastos humanos por meio de microscopia de imagem de células vivas.

1. 24-48 horas após a sementeira, incubar os fibroblastos em 50 nM de MMP-dependente tetramethylrodamine corante éster etílico (TMRE) em meio RPMI. Este meio RPMI falte vermelho de fenol como isso pode afetar negativamente a qualidade da imagem. 1,6 uM de coloração Hoechst deve ser adicionado para visualizar os núcleos.
2. Incubar as células em solução de coloração preparado protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO _2.
3. Substituir a solução de coloração com meio RPMI (sem vermelho de fenol). Prosseguir sem um passo de lavagem e as células imediatamente de imagem. Usar a ampliação 63x e confocal a laser técnica de microscopia de varredura (microscopia de fluorescência usando alternativamenteApoTome técnica) para definir camadas únicas de células. Aplicar 37 ° C e 5% de CO ₂ para as células durante o processo de criação de imagens.
4. Quando as imagens fibroblastos, prestar a máxima atenção ao tempo de exposição aplicado de luz fluorescente como coloração TMRE pode descorar rapidamente. Defina o seu tempo de exposição adequado entre 200 e 300 ms e não exceder este intervalo. A aquisição das imagens nas configurações padronizadas é muito importante, pois um não seria capaz de fazer comparações com base na intensidade se as configurações são diferentes entre as linhas celulares.
5. Como um raio definido em torno das células é branqueada com imagem após a exposição à luz, mantenha o próximo campo visuais adequadamente distante da secção de Foto-descoloração.
6. Off-line análises são realizadas utilizando Software ImageJ (Wayne Rasband; Institutos Nacionais de Saúde, EUA).
7. Selecione seu celular de interesse, usando uma ferramenta de seleção.
8. Converter a imagem para 8 bits (Imagem <Tipo <8 bits).
9. B reduzir o ruído inespecíficosy usando a função "despeckle" (Processo <Ruído <despeckle).
10. Escolha a opção "tabelas de pesquisa - Fire" condição (Imagem <tabelas de pesquisa de Fogo <).
11. Mude na função limite para o "Acima / Abaixo" função e ajustar limiar (Imagem <Ajuste Limiar <).
12. Selecione a opção "analisar partículas opção", o que lhe dará o valor médio de cinza para cada partícula mitocondrial detectáveis ​​(Analise <analisar partículas). Salvar a lista de resultado dado como uma planilha do Excel.
13. Arquivo de resultado aberto no programa Excel e calcular a média do valor médio cinza das estruturas mitocondriais (indicado como "médio" na lista dada resultado excel).
14. Para criar um gráfico de superfície, escolha o plugin "plotagem de superfície 3D interativo" na seção plugin "3D". Aqui, você pode ajustar ainda mais a trama usando diferentes opções de exibição. Alterar as "cores originais" para "Spectrum LUT" dá a barra de escala de intensidade para o enredo apropriado.
15. Alternativamentepara usar TMRE para analisar a função mitocondrial de fibroblastos humanos por meio de imagens de células vivas, de uma combinação de a MMP-dye independente Mitotracker Verde FM ea Mitotracker MMP-dependente corante CM-H ₂ Xros pode ser usado. Mais uma vez, para fibroblastos humanos vivem microscopia imagens de células é a preferida, mas, em geral, esta alternativa tem sido também utilizado por análise FACS em outro tipo de células ^12. Ao usar esse método alternativo para medir a função mitocondrial em fibroblastos humanos, passo 3-7 da seção de protocolo 5 "Medição de mitochondrio-lisossomal co-localização em viver fibroblastos humanos" deve ser aplicada. Com isso, a sobreposição dos sinais, tanto de positivo mitocôndria para Mitotracker Verde FM e CM-H ₂ Mitotracker Xros é calculada e indica a quantidade de mitocôndria funcional como razão a todos os presentes mitocôndrias.

4. Medição de Morfologia mitocondrial em Viver fibroblastos humanos

1. 24-48hr após a sementeira, as células a incubar em 200 nM Mitotracker Verde FM em meio RPMI (sem vermelho de fenol), protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO _2. 1,6 uM de coloração Hoechst deve ser usada para destacar núcleos. Mitotracker Verde FM é um corante MMP-independente, que mancha todas as estruturas mitocondriais apresentar.
2. Lavar suavemente as células uma vez com PBS.
3. Adicionar meio RPMI fresco (sem vermelho de fenol), de células e de células imediatamente de imagem. Use ampliação 63x e microscopia confocal a laser técnica de varrimento (microscopia de fluorescência utilizando a técnica alternativa ApoTome) para definir camadas únicas de células.
4. Off-line análises são retirados com o uso de software ImageJ.
5. Selecione seu celular de interesse, usando uma ferramenta de seleção.
6. Converter a imagem para 8 bits (Imagem <Tipo <8 bits).
7. Reduzir o ruído inespecíficos usando o "despeckle" função (Processo Ruído <<despeckle).
8. Use o filtro de convolução para destacar mitocôndriasestruturas mitocondrial (PROCESSO <Filtros <Convolve).
9. Ajustar o limite de modo a que a relação sinal-para-ruído é apropriado (Image <Ajuste Threshold <).
10. Usando a "analisar partículas" opção, a identificação automática de estruturas mitocondriais é iniciada com base em um tamanho de pixel escolhido (Analisar <analisar partículas). Vários parâmetros mitocondriais são posteriormente calculada como a área, perímetro, eixos menor e maior ou circularidade. Estas medidas podem ser ajustados individualmente (análise de medidas <SET). Salvar a lista de resultado dado como uma planilha do Excel.
11. Abra o arquivo resultado no programa Excel. Com o uso de tais parâmetros, as análises da morfologia mitocondrial pode ser realizada. Isto inclui a definição do factor de forma que indica o grau de ramificação de uma rede mitocondrial [fórmula: (perímetro ²⁾ / (4 * PI () * area)], bem como a relação de aspecto que define o comprimento da fórmula (mitocôndrias: major eixos / eixos menores).

5. Medição da Mitochondrio-lisossomal em colocalização estar Fibroblastos Humanos

1. 24-48 horas após a sementeira, as células a incubar em 200 nM Mitotracker Verde FM e 100 nM Lyostracker Red DND-99 em meio RPMI (sem vermelho de fenol), protegida da luz durante 15 min a 37 ° C e 5% CO _2. 1,6 mM de coloração Hoechst é usado para destacar núcleos.
2. Substituir o meio com meio RPMI fresco (sem vermelho de fenol) contendo 100 nM Lyostracker Red DND-99. Este corante tem de estar presente durante a sessão de imagem inteira. Não lave as células após o período de incubação. Imediatamente imagem das células. Use ampliação 63x e técnica confocal (técnica alternativa ApoTome) para definir camadas únicas de células.
3. Off-line análises são retirados com o uso de software ImageJ.
4. Abra as duas respectivas imagens que você gostaria de analisar em termos de estatuto co-localização.
5. Converter a imagem para 8 bits (Imagem <Tipo <8 bits). Reduzir o ruído inespecíficos usando a função "despeckle" em ambas as imagens (Processo <Ruído <despeckle).
6. Escolha o plugin "Jacop" como ferramenta de co-localização análise, o que lhe dá valores para os respectivos canais e calcula o coeficiente de Pearson, coeficiente de sobreposição e coeficiente Manders (Plugins <Jacop).

6. Resultados representativos

Função mitocondrial em viver fibroblastos humanos pode ser avaliada através da técnica ao vivo célula de imagem. Para os ensaios funcionais, o sinal de fluorescência TMRE se correlaciona com o potencial de membrana mitocondrial (MMP). Sob condições normais de MMP, a fluorescência TMRE é significativamente mais elevada (Figura 1A, fila superior) do que em condições patológicas caracterizadas por um MMP reduzida (Figura 1A, linha inferior). Esta intensidade de fluorescência é medida através do cálculo da média do valor médio de cinzento de cada estrutura mitocondrial ( (figura 1A, direita).

Junto à avaliação da função mitocondrial em fibroblastos humanos, a microscopia de imagem de células vivas pode ser utilizado para definir os diferentes parâmetros da morfologia mitocondrial. Ao utilizar o Mitotracker estruturas verdes FM corantes mitocondriais são visualizados independentemente da sua respectiva MMP (Figura 2). Isso é importante para garantir a inclusão de todas as estruturas mitocondriais presentes nas análises. Usando ImageJ Software, a morfologia é analisada com base nas figuras binárias, uma vez que apenas os parâmetros morfológicos aqui mitocondriais podem ser avaliadas (Figura 2, "binário"). Exemplos para análise da morfologia mitocondrial, em termos de factor de forma, bem como relação de aspecto foram publicados recentemente ^{6, 1}3. Uma outra característica importante que pode ser medido em fibroblastos humanos vivos é a degradação das estruturas mitocondriais. O primeiro passo neste progresso pode ser avaliada por mitochondrio-lisossomal colocalização em microscopia vivo de células de imagem. Determinados estados patológicos resultantes de uma co-localização de mitocôndria aumentou com os lisossomas (Figura 3A). Novamente, Mitotracker Verde FM é usado para corar as estruturas mitocondriais, independentemente da sua respectiva MMP. Além disso, a coloração com Lyso Tracker red DND-99 permite visualizar estruturas lisossomais. É fundamental que o corante Vermelho Lyso Tracker está presente durante o processo de criação de imagens, como etapas de lavagem reduzem o sinal que se torna demasiado baixo para visualização. Colocalização é representado por claros sinais de fluorescência amarela devido à sobreposição de o verde (verde Mitotracker FM) e vermelho (Lyso Tracker red DND-99) de coloração (setas brancas, Figura 3A) e são determinados por cálculo do coe Pearsonfficient (Figura 3B).

Em geral, para fora da linha de análises com software ImageJ, é útil para visualizar uma célula por imagem, de modo que a definição de uma região específica de interesse (ROI) possam ser evitadas.

Figura 1. Medição do sinal de fluorescência TMRE indicando o potencial de membrana mitocondrial (MMP), em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. (A) é um corante TMRE MMP-dependente fluorescente, cuja intensidade de fluorescência se correlaciona com a MMP. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Sob condições normais de MMP (linha de cima), a fluorescência TMRE é significativamente maior do que em condições patológicas caracterizadas por um MMP reduzida (linha de baixo). A intensidade da fluorescência é adicionalmente mostradacomo plotagem de superfície intensidade. Barra de escala indica 10 um. (B) A análise estatística dos fibroblastos exemplar mostrado em (A). Em condições patológicas, uma fluorescência TMRE diminuição das mitocôndrias é medido em relação à condição MMP normal. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Medição da morfologia mitocondrial em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. Mitotracker Verde FM (verde) é usado para visualizar estruturas mitocondriais, para que ele é independente da MMP. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Usando Software ImageJ, a morfologia pode ser analisado em números binários. Barra de escala indica 10 m. Clique aqui para ver maior figura.

Figura 3. Medição da co-localização de mitocôndrias com lisossomas em fibroblastos humanos vivos, pela técnica de imagem ao vivo de células. (A) Mitotracker Verde FM (verde) é usado para corar as estruturas mitocondriais, Lyostracker Red DND-99 (vermelho) visualiza estruturas lisossomais. Corante Hoechst foi utilizado para corar núcleos (azul). Colocalização bem sucedida sob as condições patológicas é indicado por um sinal de amarelo devido à sobreposição de Red Lyso Tracker e coloração Mitotracker Green (setas brancas). Barra de escala indica 10 um. (B) A análise estatística dos fibroblastos exemplar mostrado em (A). Um maior grau de resultados mitochondrio-lisossomais colocalização de um valor elevado coeficiente de Pearson./ 4228/4228fig3large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

Discussion

Fibroblastos da pele do paciente como modelos ex vivo representam uma ferramenta importante para caracterizar a doença associadas defeitos genéticos. Além disso, a pele derivados de fibroblastos são facilmente acessíveis e podem ser expandidos a cultura. Portanto, as células primárias obtidas a partir de pacientes portadores de PD-associadas mutações genéticas são preferíveis durante a utilização de linhas de células de tumor uma vez que contêm não só o gene causador de doença endógena, mas o fundo inteiro genética do indivíduo afectado. Além disso, os fibroblastos foram mostrados para reflectir importantes características patológicas da disfunção mitocondrial durante a neurodegeneração. As experiências descritas no presente protocolo são especialmente úteis para o estudo, incluindo a função mitocondrial fenótipos, morfologia, bem como a avaliação de co-localização com lisossomas mitocôndrias via técnica vivo de células de imagem. Com o mesmo, características principais da doença, ou seja, a disfunção mitocondrial e degradantes subsequenteção destes organelos não-funcionais, pode ser visualizada e analisada adequadamente ^{6, 13.} Alterações da função mitocondrial e morfologia são muitas vezes um primeiro passo da patologia da doença. Por exemplo, o aumento da fragmentação da rede mitocondrial pode ser um pré-requisito de processos melhorados e autofágicos mitophagic ^6,12. Por conseguinte, a co-localização de mitocôndrias com lisossomas pode ajudar a avaliar a degradação mitocondrial (mitophagy) ^6. A falta desta colocalização, bem como a acumulação de mitocôndrias com lisossomas pode reflectir defeitos na via de degradação lisossomal e tem de ser validado pelo fluxo autofágica modulando ^6. Neste contexto, ImageJ Software representa uma importante ferramenta para gerar conjuntos de dados validados pelo meia-automáticas não-tendenciosas funções de análise.

Uma opção adicional que se estende à utilização de fibroblastos humanos para mais relacionados com a doença é a modelos gerando potencialiões de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células, que podem ser diferenciadas em tipos de células diferentes que são alvo principal do processo da doença ^14. No caso da doença de Parkinson, a diferenciação dos fibroblastos em neurónios dopaminérgicos torna este modelo celular uma ferramenta promissora para futuras pesquisas nesta desordem neurodegenerativa ^15,16. Mais importante ainda, todos os ensaios descritos no protocolo aqui podem ser facilmente convertidos em montagens experimentais para investigar alterações mitocondriais dentro neurónios dopaminérgicos. Naturalmente, ainda mais específico para neurónios experimentos de imagem de células vivas pode ser aplicada, também.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
H–chst 33342	Invitrogen	H-3570
Table 1. Specific reagents and equipment.