軟骨アガロースゲルの機械的刺激
Summary
軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。
Abstract
機械的傷害や変形性関節症などの疾患による劣化によって破損時の関節軟骨は、限られた修復能力に苦しんでいる。この欠点を改善するために、いくつかの医療介入が開発されている。そのような方法の一つは、組織工学軟骨損傷した領域を再浮上することですが、設計された組織は、典型的には、長期的な存続可能性に疑問を投げかけ、ネイティブ軟骨の生化学的特性と耐久性を欠いている。これは、注入材料を保護するために、周囲の組織に頼らず、小焦点欠陥の修理に軟骨組織工学の応用を制限します。開発組織の特性を改善するために、機械的な刺激は、軟骨細胞外マトリックスの合成と同様に設計された組織の結果として得られる機械的特性を向上させるために利用される一般的な手法です。機械的な刺激は、組織への力は、生体内で経験したものと類似の構築に適用されます。この機械的な環境は、部分的には、天然組織1,2の開発と保守を調節していることを前提としている。軟骨組織工学における機械的刺激の最も一般的に適用されたフォームは1Hz 1,3の周波数で約5〜20％の生理的な歪みにおける動的圧縮です。いくつかの研究では、動的圧縮の影響を調査して、それが最終的に開発された4月8日組織の機能的特性に影響を与える、軟骨細胞代謝と生合成にプラスの効果を有することが示されています。本稿では、機械的に、動的圧縮下で軟骨細胞 – アガロースハイドロゲル構造体を刺激し、生化学的および放射性同位体のアッセイを通じて生合成の変化を分析するための方法を示す。また、この方法は容易に機械的刺激の結果として細胞応答におけるどんな潜在的に誘発された変化を評価するために変更することができます。
Protocol
1。プライマリ関節軟骨細胞の単離動物の関節の関節面から収穫10月15日全層軟骨スライス（ローカルabbatoirから得られた骨格成熟した牛の中手·指関節など ）。 37℃で2時間、ハムF-12（w / v）の中の0.5％プロテアーゼ20mlの100mmペトリ皿とインキュベート℃の場所軟骨スライスハムF-12培地で3回リンスした後、0.15％コラゲナーゼ20mlで37℃で一晩インキュベート?…
Discussion
細胞播種アガロースヒドロゲルへの制御された機械的刺激を加えるための記載された方法は、軟骨代謝に及ぼす動的圧縮力の影響への直接調査を行うことが可能。保持リングと一緒にカスタム·テスト·リグを使用することによって、サンプルの転倒の潜在的な問題を回避するための構成体の横方向の制約を提供した。セットのクルーによって保護死ん加重ローディングプラテンを使用す…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
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Cite This Article
Kaupp, J. A., Weber, J. F., Waldman, S. D. Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels. J. Vis. Exp. (68), e4229, doi:10.3791/4229 (2012).