Mekanisk stimulering af chondrocyt-agarose Hydrogeler
Summary
Biosyntesen af bruskagtig extracellulær matrix ved hjælp af chondrocytter kan påvirkes af anvendelse af mekaniske stimuli. Denne metode beskriver teknik for at anvende dynamiske trykstyrke stammer til chondrocytter indkapslet i 3D konstruktioner og evalueringen af inducerede ændringer i chondrocyt stofskifte.
Abstract
Ledbrusk lider af en begrænset reparationskapacitet beskadiget på grund af mekanisk defekt eller nedbrydes af sygdomme, såsom osteoarthritis. For at afhjælpe denne mangel, har flere medicinske indgreb blevet udviklet. En sådan metode er at dukke op igen det beskadigede område med væv-manipuleret brusk, men den konstruerede væv typisk mangler de biokemiske egenskaber og holdbarhed for indfødte brusk, spørgende sit langsigtede overlevelsesevne. Dette begrænser anvendelsen af bruskvæv engineering til reparation af små fokale defekter med henvisning til det omgivende væv for at beskytte den implanterede materiale. At forbedre egenskaberne af den udviklede væv, mekanisk stimulering er en populær metode anvendes til at forstærke syntesen af bruskagtig extracellulær matrix såvel som de resulterende mekaniske egenskaber af konstruerede væv. Mekanisk stimulering anvender kræfter til vævskonstruktioner analog med dem, der opleves in vivo. Detteer baseret på den forudsætning, at den mekaniske miljø, til dels regulerer udvikling og vedligeholdelse af nativt væv 1,2. De mest almindeligt anvendte form for mekanisk stimulation i bruskvæv engineering er dynamisk kompression ved fysiologiske stammer af ca 5-20% ved en frekvens på 1 Hz 1,3. Adskillige undersøgelser har undersøgt effekten af dynamisk kompression og har vist, at det har en positiv effekt på chondrocyt metabolisme og biosyntese, i sidste ende påvirker de funktionelle egenskaber af den udviklede væv 4-8. I dette dokument viser vi fremgangsmåden til mekanisk at stimulere chondrocyt-agarose hydrogel konstruktioner under dynamisk kompression og analysere ændringer i biosyntesen via biokemiske og radioisotop assays. Denne metode kan også let modificeres til at vurdere potentielt inducerede ændringer i cellulær reaktion som følge af mekaniske stimuli.
Protocol
Discussion
Den beskrevne metode til påføring af kontrollerede mekaniske stimuli til celle-seedede agarose hydrogeler giver mulighed for direkte undersøgelse af virkningerne af dynamiske trykkræfter på chondrocyt stofskifte. Brugen af custom-prøvningsapparaturet i forbindelse med de låseringe forudsat lateral begrænsning for konstruktionerne for at undgå potentielle problemer med prøve deponering. Brugen af døde-vægtede loading plader sikret ved sæt besætninger sikrer direkte kontakt med konstruktion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | SH3001002 | |
| Collagenase A | Sigma Aldrich Ltd. | C0130 | |
| Protease | Sigma Aldrich Ltd. | P5147 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich Ltd. | F1051 | |
| Ascorbate | Sigma Aldrich Ltd. | A4034 | |
| Antibiotics/antimycotics | Sigma Aldrich Ltd. | A5955 | |
| HEPES | Bioshop Canada Ltd. | HEP001 | |
| Trypan blue | Sigma Aldrich Ltd. | 93595 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Quant-iT PicoGreen | Invitrogen | P7589 | |
| Papain from papaya latex | Sigma Aldrich Ltd. | P3125 | |
| Ammonium Acetate | Sigma Aldrich Ltd. | A1542 | |
| Ethyldiaminetetraacetic Acid | Sigma Aldrich Ltd. | E9884 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich Ltd. | 43819 | |
| Low Melting Point Agarose, Type VII | Sigma Aldrich Ltd. | A9045 | |
| Mesh Screen (200) Filter | Sigma Aldrich Ltd. | S4145 | |
| Mach-1 Micromechanical Tester | Biomomentum Inc. | V500cs | |
| Compression Loading Jig | Custom-built | Similar product could be supplied by Biomomentum Inc. | |
| Falcon 24 Well Culture Plate | Thermo Fisher Scientific | B353047 | |
| β-Liquid Scintillation Counter | Beckman Coulter | LS6500 | |
| [3H] Proline | Perkin-Elmer | NET323005MC | |
| [35S] Sulfur | Perkin-Elmer | NEX041005MC |
References
- Grodzinsky, A. J. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).
- Kuettner, K. E. Biochemistry of articular cartilage in health and disease. Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).
- Neu, C. P. The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).
- Demarteau, O. Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).
- Hunter, C. J. Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness. Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).
- Buschmann, M. D. Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture. Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).
- Quinn, T. M. Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants. Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).
- Kuettner, K. E. Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology. The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).
- Lee, D. A. Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain. Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).
- McGowan, K. B. Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258. Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).
- Fan, J. C. Y. The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage. Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).
- Kaupp, J. A. Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).
- Waldman, S. D. Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro. Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).
- Waldman, S. D. A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).
- Kisiday, J. D. Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds. Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).
- Chowdhury, T. T. Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).
