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Biology

ルシフェラーゼ生物発光レポーターを用いた遺伝子発現のモニタリング細胞自律的な概日時計のリズム

Published: September 27, 2012
doi:
10.3791/4234
, , , ,
1Department of Biological Sciences,The University of Memphis

Summary

概日時計は、個々の細胞内で機能する、すなわち、それらは細胞自律的である。ここでは、非侵襲的、ルシフェラーゼベースのリアルタイム生物発光技術を用いた細胞自律的なクロックモデルを生成するための方法を説明します。レポーター細胞は、概日生物学を研究するのに扱いやすい、機能的なモデル系を提供する。

Abstract

哺乳動物では、行動や睡眠覚醒サイクルと肝臓代謝などの生理機能の多くの側面は、内因性の概日時計（1,2日 ）によって規制されている。サーカディアン計時システムは、同期や他の場所で1,2エクストラSCNおよび周辺クロックを調整する視交叉上核（SCN）に位置し、中央のクロックで、階層的なマルチ発振器ネットワークです。個々の細胞は、概日リズム3,4、および生物シェアの異なる組織型著しく類似した生化学的な負のフィードバック機構のこれらの発振器の生成と維持のための機能部である。しかし、SCNの神経ネットワークレベルおよび生物体レベルでリズミカルな、全身の手がかりを通じて相互作用のために、生物体レベルで概日リズムが細胞自律的な5-7というわけではありません。 生体とSCNの外植片のex vivo、cの自発運動の伝統的な研究に比べエルベースインビトロアッセイは、細胞自律的な概日5,8欠陥の発見を可能にします。戦略的には、細胞ベースのモデルは、表現型の特徴と基本的な時計機構5,8-13の迅速な発見のために、より実験的に扱いやすいです。

概日リズムは動的であるため、高い時間分解能で縦測定は、時計機能を評価する必要があります。近年では、レポーターとしてホタルルシフェラーゼを用いたリアルタイム生物発光の記録は、それが分子リズムの永続性とダイナミクスの検討を可能にするように、哺乳類14,15の概日リズムを研究するための一般的な手法となっています。遺伝子発現の細胞自律的な概日リズムを監視するには、ルシフェラーゼレポーターは、一過性のトランスフェクション13,16,17または安定した伝達5,10,18,19を介して細胞内に導入することができる。ここでは、レンチウイルス媒介遺伝子送達を用いて安定した伝達プロトコルを記述します。 T彼は、レンチウイルスベクターシステムは、その効率性と汎用性の一過性トランスフェクション及び生殖系列伝達など、従来の方法よりも優れている：それは分割し、非分裂細胞20の両方の宿主ゲノムへの効率的な配信と安定した統合を可能にします。レポーター細胞株が確立されると、時計機能のダイナミクスは、生物発光の記録を使って調べることができます。我々は最初のP（PER2）-D Lucレポーターライン、その後これと他のサーカディアン記者から存在するデータの生成を説明します。これらのアッセイにおいて、3T3マウス線維芽細胞およびU2OSヒト骨肉腫細胞は細胞モデルとして使用されています。我々はまた、概日の研究では、これらのクロックモデルのさまざまな使用方法について説明します。ここで説明する方法は、概日時計の細胞·分子レベルで研究する細胞種の多種多様に適用することができ、かつ他の生物系で問題に取り組む上で役立つことがあります。

Protocol

1。レンチウイルスルシフェラーゼレポーターの構築哺乳類の概日レポーターコンストラクトは、通常の概日プロモーターがルシフェラーゼ遺伝子と融合された発現カセットを含んでいます。両方のライゲーションと組み換えベースの戦略は、一般的にDNAクローニングのために使用されます。例として、ここでは、不安定化ルシフェラーゼ （D リュック…

Discussion

1。現在のプロトコルへの変更

1.1記録デバイスとスループットの考慮事項

なぜなら、その商業的利用可能性、LumiCycle（Actimetrics）は、リアルタイムレコーディング4,5,9,19,29-31ための最も一般的に使用される自動化されたルミノデバイスとなっています。 LumiCycleは非常に高感度、低ノイズ14を提供する光検出器として、光電子増倍管…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国立科学財団（IOS-0920417）（ACL）によって部分的にサポートされていました。

Materials

Name of reagent Company Catalogue number Comments
DMEM HyClone SH30243FS For regular cell growth
DMEM Invitrogen 12100-046 For luminometry
FBS HyClone SH3091003  
Pen/Strep/Gln(100x) HyClone SV3008201  
B-27 Invitrogen 17504-044  
D-Luciferin Biosynth L-8220  
Poly-L-lysine Sigma P4707  
Polybrene Millipore TR-1003-G  
Forskolin Sigma F6886  
All other chemicals Sigma    
Equipment
Tissue culture incubator     5% CO2 at 37°C
Tissue culture hood     BSL-2 certified
Light & fluorescent microscope     Phase contrast optional
LumiCycle Actimetrics    
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Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J. Vis. Exp. (67), e4234, doi:10.3791/4234 (2012).
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