Drenaggio manuale dei ventricoli cerebrali embrionali zebrafish
Summary
Presentiamo un metodo per raccogliere il fluido cerebrospinale (CSF) e per creare un sistema che manca CSF nel sistema ventricolare cerebrale embrionale zebrafish. Ciò consente un ulteriore esame della composizione CSF e il suo fabbisogno durante lo sviluppo embrionale del cervello.
Abstract
Liquido cerebrospinale (CSF) è un fluido ricco di proteine contenute nei ventricoli cerebrali. E 'presente durante le prime fasi dello sviluppo embrionale dei vertebrati e persiste per tutta la vita. Adulto CSF è pensato per attutire il cervello, rimuovere i rifiuti, e portare secreta 1,2 molecole. Nell'embrione adulti e anziani, la maggior parte di CSF è fatta dal plesso coroide, una serie di regioni altamente vascolarizzati secretori adiacenti al cervello ventricoli 3-5. In zebrafish, la coroide plesso è completamente formato a 144 dopo la fecondazione ore (HPF) 6. Prima di questo, negli embrioni dei vertebrati sia zebrafish e altre cui mouse, una quantità significativa di embrionale CSF (eCSF) è presente. Questi dati e studi suggeriscono che il pulcino è neuroepitelio secretoria presto nello sviluppo e può essere la principale fonte di eCSF prima del plesso coroide sviluppo 7.
eCSF contiene circa tre volte più proteine than adulto CSF, suggerendo che essa può avere un ruolo importante durante lo sviluppo 8,9. Studi in pulcino e topo dimostrano che i fattori secreti nel eCSF, pressione del fluido, o una combinazione di questi, sono importanti per la neurogenesi, sopravvivenza espressione genica, la proliferazione cellulare, e nella cella neuroepitelio 10-20. Analisi proteomica di umano, ratto, topo, e pulcino eCSF hanno identificato molte proteine che potrebbero essere necessari per la funzione LCR. Questi includono componenti della matrice extracellulare, apolipoproteine, proteine che regolano la pressione osmotica, e proteine coinvolte nella morte cellulare e proliferazione 21-24. Tuttavia, le funzioni complesse del eCSF sono largamente sconosciuti.
Abbiamo sviluppato un metodo per la rimozione eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish, consentendo così l'identificazione dei componenti eCSF e per l'analisi del fabbisogno eCSF durante lo sviluppo. Anche se più eCSF possono essere raccolti da altri vertebrati sistemi with embrioni più grandi, eCSF possono essere raccolti fin dalle prime fasi di sviluppo zebrafish, e in condizioni genetiche o ambientali che portano a volume anormale ventricolo del cervello o la morfologia. La rimozione e la raccolta di eCSF permette l'analisi di spettrometria di massa, l'indagine della funzione eCSF, e la reintroduzione di elementi selezionati nei ventricoli di test la loro funzione. Così l'accessibilità del zebrafish precoce consente un'analisi dettagliata della funzione eCSF durante lo sviluppo.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'uso di questa tecnica per drenare manualmente eCSF dai ventricoli cerebrali zebrafish sarà utile per determinare la necessità di eCSF durante lo sviluppo. Inoltre, questa tecnica consente descrizione del profilo proteico eCSF nel corso dello sviluppo embrionale. Identificazione di proteine differenti durante questo periodo consentirà ulteriori indagini sul funzionamento del CSF e il suo ruolo potenziale durante lo sviluppo del cervello. In amnioti, alcuni fattori di cui eCSF (IGF2, FGF2, acido retinoico, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute for Mental Health, e la National Science Foundation. Un ringraziamento particolare al Dr. Jen Gutzman, Dr. Amanda Dickinson e altri membri di laboratorio esclusivo per molte utili discussioni e critiche costruttive, e di Olivier Paugois per l'allevamento dei pesci di esperti.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Eppendorf CellTram Oil | Eppendorf | 516 000.025 |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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