कपाल mesenchyme प्रक्रिया नाटकीय morphogenic आंदोलनों की संभावना है कि तंत्रिका परतों के उन्नयन के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करता है<sup1,2></sup>. यहाँ हम एक सरल का वर्णन<em> पूर्व vivo</em> परख explant neurulation दौरान कपाल mesenchyme के सेलुलर व्यवहार चिह्नित. इस परख औषधीय जोड़तोड़ और रहते इमेजिंग विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी होने सहित कई आवेदन किया है.
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र तंत्रिका प्लेट कि जटिल morphogenetic न्यूरल ट्यूब के एक neurulation के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में गठन में जिसके परिणामस्वरूप आंदोलनों की एक श्रृंखला की प्रक्रिया से ली गई है. Neurulation दौरान, mesenchyme कि तंत्रिका प्लेट underlies morphogenesis के लिए तंत्रिका गुना ऊंचाई ड्राइव करने के लिए माना जाता है. कपाल mesenchyme paraxial mesoderm और तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के शामिल है. कपाल mesenchyme प्रपत्र की कोशिकाओं एक pourous तारामय आकार की कोशिकाओं से बना है और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) किस्में है कि तंत्रिका परतों का समर्थन खुलेपन meshwork. Neurulation दौरान, कपाल mesenchyme टकसाली इसके विस्तार में जिसके परिणामस्वरूप rearrangements आए और इन आंदोलनों के लिए तंत्रिका गुना ऊंचाई के लिए एक प्रेरणा शक्ति प्रदान करने के लिए माना जाता है. हालांकि, रास्ते और सेलुलर व्यवहार है कि कपाल mesenchyme morphogenesis ड्राइव खराब अध्ययन रहते हैं. ECM और कपाल mesenchyme underly thes की कोशिकाओं के बीच सहभागिताई सेल व्यवहार. यहाँ हम इन कोशिकाओं के व्यवहार को चिह्नित करने के लिए तैयार एक साधारण पूर्व vivo explant परख का वर्णन. इस परख औषधीय जोड़तोड़ संशोधनीय संकेत दे रास्ते शामिल हैं और रहते इमेजिंग विश्लेषण काटना करने के लिए आगे इन कोशिकाओं के व्यवहार की विशेषताएँ हैं. हम एक प्रतिनिधि ईसीएम घटकों की एक किस्म पर कपाल mesenchyme के प्रवासी गुण निस्र्पक में इस परख की उपयोगिता का प्रदर्शन प्रयोग उपस्थित थे.
कपाल क्षेत्र में न्यूरल ट्यूब बंद भ्रूण दिन (E8.5) 8.5 और 9.5 माउस भ्रूण के बीच होता है. विफलता ठीक से सिर परिणामों में anencephaly, एक आम मानव में संरचनात्मक जन्म दोष में न्यूरल ट्यूब और करीब जीवन के साथ असंगत है. बलों है कि मस्तक न्यूरल ट्यूब बंद ड्राइव दोनों ही तंत्रिका ऊतक और आसपास के epidermis और 3 mesenchyme से उत्पन्न कर रहे हैं. कपाल mesenchyme की विशेष विस्तार में कपाल तंत्रिका सिलवटों 1,2 के उन्नयन के लिए आवश्यक माना जाता है. कपाल mesenchyme हेपरिन सल्फेट proteoglycans, chondroitin sulfates और Hyaluronate 4-8 के रूप में विशेष ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन में ECM प्रोटीन में समृद्ध है.
चिकन भ्रूण जहां तंत्रिका शिखा कोशिकाओं न्यूरल ट्यूब बंद होने के बाद पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से बसने में विपरीत, माउस भ्रूण में तंत्रिका शिखा एक ही समय में migrates है कि तंत्रिका सिलवटों अनुसंधान करने के लिए शुरूise (5 कायखंड चरण के बाद). इस प्रकार माउस भ्रूण में neurulation के दौरान, कपाल mesenchyme तंत्रिका शिखा और paraxial mesoderm से निकाली गई कोशिकाओं से बना है. तंत्रिका शिखा और paraxial mesoderm आबादी विकास में अलग अलग समय पर प्रेरित कर रहे हैं, भ्रूण में विभिन्न स्थानों में स्थानीय और अलग 9,10 संरचनाओं में विकसित करना. paraxial mesoderm आदिम लकीर से निकलती है और भ्रूण के पूर्वकाल क्षेत्र प्रकल्पित तंत्रिका प्लेट आबाद करने के लिए migrates. तंत्रिका शिखा तंत्रिका प्लेट और epidermal बाहरी झिल्ली के जंक्शन पर प्रेरित किया जाता है, एक संक्रमण mesenchyme उपकला आए और सिर्फ कृंतक भ्रूण में तंत्रिका गुना ऊंचाई से पहले delaminates. तंत्रिका शिखा कोशिकाओं गिल चाप, ललाटनासास्थिक और periocular mesenchyme subectodermal paraxial mesoderm में stereotypic रास्तों साथ विस्थापित. paraxial mesoderm खोपड़ी वॉल्ट और चेहरे की मांसपेशियों की हड्डियों में से कुछ के लिए योगदान देगा, जबकि वेंई तंत्रिका शिखा कपाल 9-11 नसों के अलावा खोपड़ी और चेहरे के अन्य हड्डियों के लिए योगदान देगा. paraxial mesoderm और तंत्रिका शिखा प्रजातियों विभिन्न Mesp1 – रचनात्मक और Wnt1 रचनात्मक ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, क्रमशः 9 द्वारा चिह्नित किया जा सकता है.
न्यूरल ट्यूब बंद करने में कपाल mesenchyme की अनिवार्य भूमिका प्रयोगों से inferred किया गया है जहां ईसीएम में खलल न डालें बिगड़ा neurulation तंत्रिका ट्यूब 7 बंद करने के दौरान hyaluronidase chondroitinase एबीसी, heparitinase या Diazo-oxo-norleucine (डॉन) के रूप में इस तरह के एजेंटों के साथ कृंतक भ्रूण के उपचार, 12-14. इन प्रयोगों में, स्थिर वर्गों के histological neurulation विश्लेषण के बाद की कपाल mesenchyme 7,12-14 जुड़े dysmorphogeneis का पता चला. हालांकि, बाद teratogenic एजेंट कई ऊतकों को उपयोग किया था, यह निर्धारित किया जाना बना रहता है अगर कपाल mesenchyme वास्तव में लक्ष्य ऊतक है. निष्कर्ष के समर्थन में है कि इस ऊतकneurulation के लिए आवश्यक है, कपाल mesenchyme कुछ माउस म्यूटेंट में 15-17 exencephaly histological विश्लेषण पर असामान्य प्रतीत होता है. फिर भी, ज्यादातर मामलों में, कपाल mesenchyme की सेलुलर व्यवहार पर उत्परिवर्तन के प्रभाव को संबोधित किया गया नहीं किया गया है.
हम एक पूर्व vivo explant सीधे आनुवंशिक या कपाल mesenchyme 15 कोशिकाओं के व्यवहार पर औषधीय हेरफेर उत्परिवर्तन के परिणाम की जांच परख करने के लिए तैयार कर लिया है. इस परख कि एट 2003 Tzahor अल द्वारा प्रकाशित कपाल mesenchyme के भेदभाव क्षमता का उपयोग करने के लिए इसी तरह की है कि underlies सभी 18 rhombomeres को छोड़कर हम explant विच्छेदन को संशोधित किया है कपाल mesenchyme की अधिक पूर्वकाल आबादी के प्रवासी गुणों का अध्ययन है कि तंत्रिका पूर्वकाल आबाद थाली. हमारी विधि भी explant assays के एक संशोधन चिकन भ्रूण में प्रदर्शन के साथ तंत्रिका शिखा के प्रवासी व्यवहार का विश्लेषण हैy मतभेद. पिछला तैयारी तंत्रिका शिखा या अधिक पीछे paraxial mesoderm 19,20 explanted है. इसके अलावा, चिकन भ्रूण में तंत्रिका गुना ऊंचाई के दौरान, तंत्रिका शिखा अभी तक पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से emigrated गया है और इस प्रकार पूर्वकाल paraxial mesoderm लिया explants तंत्रिका शिखा कोशिकाओं नहीं शामिल होगा. हमारे परख में, कपाल mesenchyme paraxial mesoderm, तंत्रिका शिखा और सतह बाह्य त्वक स्तर के निर्वाचकगण explants तैयार कर रहे हैं एक सब्सट्रेट पर चढ़ाया. आनुवंशिक म्यूटेंट से explants के अलगाव, अलग ECM या औषधीय उपचार पर explants चढ़ाना सहित प्रायोगिक हेरफेर किया जा सकता है. Explant और दूरी, संख्या और व्यवहार से विस्थापित कोशिकाओं और विश्लेषण किया जा सकता है उपचार समूहों के बीच तुलना में. इसके अलावा, इस तैयारी रहते इमेजिंग तकनीक से विश्लेषण करने के लिए सेलुलर प्रवास के संशोधनीय है. माइग्रेशन प्रयोग के बाद, explants और तय किया जा सकता है फर के लिए immunohistochemical विश्लेषण करने के लिए किया जाता हैवहाँ उपचार के प्रभाव को स्पष्ट. कुल मिलाकर, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक साधारण पूर्व vivo कपाल mesenchyme के व्यवहार की जांच परख है. एक प्रतिनिधि के प्रयोग के रूप में, हम इस परख का उपयोग करने के लिए विभिन्न कोशिकी substrates पर कपाल mesenchyme के प्रवास की जांच.
यहाँ लागू विधि कपाल mesenchyme कोशिकाओं के व्यवहार की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली परख प्रदान करता है. स्थैतिक यहाँ प्रस्तुत विश्लेषण करने के लिए इसके अलावा, उज्ज्वल क्षेत्र में या संयोजन में GFP-लेबल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ इमेजिंग प्रयोगों जीने के लिए वास्तविक समय में कोशिकाओं के व्यवहार की जांच के रूप में वे explant से विस्थापित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. रहते इमेजिंग प्रयोगों के लिए, explants DiI साथ लेबल किया जा सकता है या paraxial mesoderm, रोजा YFP से तंत्रिका शिखा के प्रवास अंतर Mesp1 – रचनात्मक या रोजा – YFP; Wnt1 – रचनात्मक या अन्य ट्रांसजेनिक लाइनों इस्तेमाल किया जा सकता है. कपाल mesenchyme ECM बातचीत भी इस explant परख के उपयोग की जांच की जा सकता है. यहाँ हम अलग ECM substrates है कि कपाल mesenchyme में मौजूद पता चलता है कि कोशिकाओं के विभिन्न डिग्री के लिए इन पर विस्थापित ईसीएम कोशिकाओं की आकारिकी प्रभावित कर रहे हैं पर थाली explants. इसके अलावा, एक तीन आयामी मैट्रिक्स में explants एम्बेड किया जा सकता है cel के व्यवहार का उपयोगइस संदर्भ में रास. यह explant कपाल mesenchyme के लिए आंतरिक और बाह्य संकेत है कि विनियमित और प्रवास को संशोधित कर सकते हैं का विश्लेषण व्यवहार पर आनुवंशिक और औषधीय जोड़तोड़ के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए संशोधनीय परख है. उदाहरण के लिए, हम अपने अध्ययन में इस परख का उपयोग Hectd1 उत्परिवर्ती कपाल 15 mesenchyme में असामान्य सेलुलर व्यवहार में अतिरिक्त Hsp90 स्राव की भूमिका विचार. इन प्रयोगों में, हम विरोधी Hsp90 एंटीबॉडी के साथ explants Hsp90 प्रोटीन, geldanamycin और डीएमए (डाइमिथाइल amelioride) का इलाज किया Hsp90 के स्राव को दिखाना है कि Hectd1 उत्परिवर्ती कोशिकाओं के असामान्य व्यवहार के कारण अतिरिक्त कोशिकी Hsp90 15 है ब्लॉक. समान दृष्टिकोण pharmacologically अतिरिक्त कपाल mesenchyme के सामान्य या असामान्य morphogenesis अंतर्निहित रास्ते टुकड़े करना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक बार परख पूरा हो गया है, explants और पलायन कोशिकाओं तरीकों की एक मेजबान से विश्लेषण किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, immunohistochemical विश्लेषण करती है गएक सेल आंदोलनों के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन का स्थानीयकरण की जांच करने के लिए नियोजित किया जा. Transcriptome विश्लेषण भी निर्धारित करने के लिए कैसे उपचार जीन की अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.
इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण सीमा यह है कि यह तीन आयामों में मॉडल व्यवहार के रूप में वे vivo में घटित होता नहीं है. प्रोटोकॉल जहां explants फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में चिह्नित सेलुलर डिब्बों की अभिव्यक्ति के साथ एक तीन आयामी मैट्रिक्स (जैसे Matrigel) में एम्बेडेड रहे हैं की इस मुद्दे के समाधान के लिए आवश्यक संशोधन नियोजित किया जा सकता है. यहां तक कि अगर इन संशोधनों प्रदर्शन किया गया, आगे vivo में उन लोगों के साथ इस पूर्व vivo परख में देखा व्यवहार सहसंबंधी प्रयोगों के लिए आवश्यक होगा. अन्य सीमाओं statically महत्वपूर्ण डेटा उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त संख्या उत्पन्न करने के लिए आवश्यक भ्रूण की बड़ी संख्या में शामिल हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, विच्छेदन अपेक्षाकृत सरल है, यह मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है.
The authors have nothing to disclose.
यह काम R01 HD058629 द्वारा IEZ समर्थित है