Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Zusammenfassung

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Zusammenfassung

Klassische Methoden zur Untersuchung neuronaler Schaltkreise sind ziemlich geringen Durchsatz. Transsynaptische Viren, insbesondere das Pseudorabiesvirus (PRV) und Tollwutvirus (RABV) und neuerdings vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV), eine Schaltung zur Untersuchung, wird immer beliebter. Diese höheren Durchsatz Methoden verwenden Viren, die zwischen den Neuronen entweder in der anterograde oder retrograde Richtung übertragen.

Kürzlich wurde eine modifizierte RABV für monosynaptischen retrograden Tracing entwickelt. (Abbildung 1A). Bei diesem Verfahren wird das Glycoprotein (G)-Gen aus dem viralen Genom gelöscht und wieder zugeführt nur in gezielter Neuronen. Infektion Spezifität wird durch Substituieren eines chimären G, der extrazellulären Domäne des ASLV-A Glykoprotein und die zytoplasmatische Domäne des RABV-G (A / RG) zusammengesetzt ist, für die normale RABV-G ¹ gelöst. Dieses chimäre G gezielt infiziert Zellen, die den ^{TVA-Rezeptor-1.} Das Gen kodiert TVA kann schon delivered durch verschiedene Verfahren ^2-8. Nach RABV-G Infektion einer TVA-exprimierenden Neuronen, kann die RABV zu anderen, synaptisch verbundenen Neuronen in retrograder Richtung von der Natur des eigenen G, die mit dem Rezeptor TVA zusammen geliefert war zu übertragen. Diese Technik kennzeichnet eine relativ große Anzahl von Eingängen (5-10%) ² auf einem definierten Zelltyp, Bereitstellen eines Probenahme von allen Eingängen auf einen definierten Starter Zelltyp.

Wir haben vor kurzem diese Technik, um VSV als transsynaptische Tracer ⁹ verwenden modifiziert. VSV hat mehrere Vorteile, einschließlich der Schnelligkeit der Genexpression. Hier haben wir ausführlich eine neue virale Tracing-System mit VSV nützlich für das Sondieren Mikrotechnik mit erhöhter Auflösung. Während die ursprünglich veröffentlichten Strategien Wickersham et al. ⁴ und Beier et al. ⁹ Erlaubnis Beschriftung bei allen Neuronen, projizieren eingangs infiziert TVA-exprimierenden-Zellen, hier VSV dazu entworfen wurde, um nur zu übertragen, um TVA-exprimierenden Zellen (Abb. 1B). Das Virus wird zuerst mit RABV-G pseudotypisiert zur Infektion von Neuronen hinter TVA-exprimierenden Neuronen ermöglichen. Nach der Infektion dieses ersten Population von Zellen, das Virus freigesetzt nur infizieren TVA-exprimierenden Zellen. Weil die transsynaptische viralen Ausbreitung auf TVA-exprimierenden Zellen, die Anwesenheit von Abwesenheit von Konnektivität von definierten Zelltypen beschränkt wird dann mit hoher Auflösung untersucht werden. Eine experimentelle Flußdiagramm dieser Versuche ist in Abbildung 2 gezeigt. Hier zeigen wir, ein Modell-Schaltung, dass der Richtungswechsel-Selektivität bei der Maus Netzhaut. Wir untersuchen die Konnektivität starburst Amakrinzellen (SAC) an retinalen Ganglienzellen (RGZ).

Protokoll

Ein. Erstellen Virus aus cDNA: Recovery von VSV aus cDNA mit Vaccinia-T7 System ¹⁰

1. Einen Tag vor zu experimentieren, aufgeteilt BsrT7 Zellen in 60 mm Schale mit DMEM + 10% FBS. Seed 2E6 Zellen pro Schale. BsrT7 Zellen aus BHK21, oder Baby-Hamster-Nierenzellen, Zellen abgeleitet.
2. Warmen PBS mit 1 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Calcium und 37 ° C.
3. Besorgen Sie sich eine kleine Teilmenge vTF7-3, ein Vaccinia-Virus, das T7-Polymerase und Auftauen auf Raumtemperatur. vTF7-3 ist eine ansteckende Vaccinia-Virus, das T7-Polymerase ^11, und sollte nur in Biosafety Level 2 Containment verwendet werden. Dieser Ausdruck wird verw....

Diskussion

Verwendung von Viren zu studieren neuronalen Schaltkreise ist eine relativ hohe Durchsatzleistung Verfahren zum Analysieren angeschlossenen Neuronen. Allerdings Erzeugung sowohl VSV und RABV Virionen ist nicht trivial. Obwohl die obige Protokoll zur Rettung Virus aus cDNA aufgeführten vorgesehen ist, ist es immer noch ein geringer Wahrscheinlichkeit Ereignis. Die Niveaus von jedem der N, P, und L Plasmide müssen fein eingestellt werden, und viele Studien und repliziert müssen getan, um virale Rettungs gewährleisten. Die.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellkultur
Baby-Hamster-Nierenzellen (BSRT7)	auf Anfrage erhältlich
Vaccinia (vTF7-3)	auf Anfrage erhältlich
pN, pP, pl-Plasmide	erhältlich auf Anfrage
Calciumchlorid	Sigma	C1016
Magnesiumchlorid	Sigma	M8266
HEK 293T-Zellen	Open Biosystems	HCL4517
60-mm-TC-behandelte Kulturschale	Corning	430166
75 cm2 Rechteckige schräg abgesetzte Zellkulturschale mit belüftetem Verschluss	Corning	430641
Medium: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Invitrogen	12491-015
1 M HEPES, pH 7,4	Gibo	15630-080
FBS: Fötales Rinderserum	Gibco	10437-028
PKS	Invitrogen	15140-163
Lipofectamin 2000 Transfektionsreagenz	Invitrogen	11668-019
Spritze: 5-ml-Luer-Lock-Spritze	Sigma	Z248010-1PAK
Spritzenfilter	Nalgene	190-2520
PEI: Linearer PEI mit hoher Wirksamkeit	Polysciences	23966
Viruszentrifugation
Corning 150 ml Tube Top Vakuumfilter-System, 0,45 μm Pore	Corning	430314
Thinwall, ultraklar, 38,5 ml, 25 x 89 mm Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman-Coulter	344058
Ultrazentrifuge	Beckman-Coulter	optima XL-80K
SW28-Ultrazentrifugenrotor	Beckman-Coulter	342207
Mausinjektion
Kapillare Mikropipetten	Drummond	5-000-2005
Stereotaxie	Narishige	SR-5M
Mikromanipulator	Narishige	SM-15
Ump-Injektor	World Precision Instruments	Sys-Micro4
Vierkanal-Mikrocontroller	World Precision Instruments	UMP3
M.TXB Tischmotor mit C.EMX-1 Drehzahlregelung, 115 Volt	Foredom	M.TXB-EM
H.10 Handstück, Schnellwechsel	Foredom	H.10
Schrittbohrer, 0,5 mm	Foredom	A-58005P
Mikroskopie–Elektrodenhalter	World Precision Instruments	MEH2S
Ketamin	Henry Schein	995-2949
Xylazin	Henry Schein	4015809TV
Buprenorphin	Henry Schein	1118217
1-ml-Spritze	Becton-Dickinson	309628
Injektionsnadel, 30 Gauge	Becton-Dickinson	305106
Schutz-Augensalbe	Doctors Foster und Smith	9N-014748
Ethanol	Sigma	493511
Jod	Sigma	PVP1
Chirurgische und Dissektionswerkzeuge
Schere	Fine Science Tools	91402-12
Standardpinzette	Fine Science Tools	11000-12
Feine Pinzette	Fine Science Tools	11255-20
Vannas-Springer-Scheren	Fine Science Tools	15000-00
Skalpellgriff	Fine Science Tools	10003-12
Skalpellerklingen	Fine Science Tools	10015-00
Nähte	Robbins Instruments	20.SK640
Dissizierung und Antikörperfärbung
Paraformaldehyd	Sigma	P6148
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P4417
Triton X-100	Sigma	T9284
Eselserum	Jackson Immunoresearch	017-000-121
Antikörper
Antikörper	Millipore	AB144P
Anti-gfp	Abcam	ab13970
Esel-anti-Huhn-Dylight 488	Jackson ImmunoResearch	703-545-155
Esel-anti-Huhn Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	705-605-147
DAPI	Invitrogen	D1306
Einbettung von Gewebe
Superfrost-plus-Mikroskopobjektträger	Fisher	12-550-100
Deckglas 22 x 22, 0 Dicke	Electron Microscopy Sciences	72198-10
Silikonelastomer	Rogers Corp	HT-6220
Klarer Nagellack	Electron Microscopy Sciences	72180
Prolong Gold Antifade-Reagenz	Invitrogen	P36930