Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Summary

Primário, fetais humanos derivado do cérebro, as células progenitoras multipotenciais proliferam<em> In vitro</em> Enquanto se mantém a capacidade de se diferenciar em neurónios e astrócitos. Este trabalho mostra que os progenitores neurais podem ser induzidas a diferenciar por estágios da linhagem oligodendrocytic por condicionamento com factores de crescimento seleccionados.

Abstract

Diferenciação de progenitores neurais humanas em tipos de células neuronais e gliais oferece um modelo para estudar e compará-regulação molecular do desenvolvimento neural de células de linhagem. Expansão in vitro de células progenitoras neurais a partir de tecido fetal CNS tem sido bem caracterizado. Apesar de a identificação e isolamento de células progenitoras da glia do adulto assunto sub-cortical humano branco e desenvolvimento de várias condições de cultura de diferenciação directa de progenitores neurais fetais em oligodendrócitos de mielina que produzem, adquirindo suficientes oligodendrócitos humanos para experimentação in vitro continua a ser difícil. Diferenciação de galactocerebrósido ⁺ (GalC) e O4 ⁺ precursor oligodendrócitos ou células progenitoras (OPC) a partir de células precursoras neurais tem sido relatado o uso de segundo trimestre cérebro fetal. No entanto, estas células não proliferam na ausência de células de suporte, incluindo os astrócitos e neurónios, e são rapidamente perdidos ao longo do tempo na cultura. Permanece a necessidade para um sistema de cultura para a produção de células da linhagem de oligodendrócitos adequado para experimentação in vitro.

Cultura de oligodendrócitos humanos primários poderiam, por exemplo, ser um modelo útil para estudar a patogénese da neurotrópicas agentes infecciosos, como o poliomavírus humanos, JCV, que in vivo infecta as células. Estas culturas de células podem também proporcionar modelos de outras doenças desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC). Primária, fetal humano derivado do cérebro, as células progenitoras neurais multipotenciais proliferam in vitro, mantendo a capacidade de se diferenciar em neurônios (células progenitoras derivadas de neurônios, PDN) e astrócitos (células progenitoras derivadas de astrócitos, PDA) Este estudo mostra que progenitores neurais pode ser induzida para diferenciar através de muitos dos estágios de desenvolvimento da linhagem oligodendrocytic (progenitor derivados de oligodendrócitos, DOP). Nós, de cultura de células progenitoras neurais em meio isento de soro F12 de DMEM-supcomplementado com um factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), factor neurotrófico 3 (NT-3), N-2 e tri-iodotironina (T3). As células cultivadas são passadas a células 2.5e6 por frascos de 75 centímetros aproximadamente de sete em sete dias. Usando estas condições, a maioria das células na cultura de manter uma morfologia caracterizada por alguns processos e marcadores expressos do pré-oligodendrócitos células, tais como A2B5 e O-4. Quando se remover os factores de crescimento de quatro (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e adicionar o meio condicionado a partir de PDN, as células começam a adquirir mais processos e os marcadores de diferenciação específicos expressos oligodendrócito, tais como GalC e mielina proteína básica (MBP). Foi realizada a caracterização fenotípica usando multicolor citometria de fluxo para identificar marcadores únicos de oligodendrócitos.

Protocol

Nota: Para a cultura de rotina de células progenitoras neurais e células da linhagem oligodendrocytic, a incubação é realizada a 37 ° C em 5% de CO 2 humidificado atmosfera. Cada 2 dias, o meio é substituído com 50 a 100% de meio fresco se a cultura é de 40-70% confluentes. No momento da confluência perto, as culturas são passadas a 2-2.5e6/T75 frasco geralmente num plano semanal. 1. Preparando o balão revestido Para preparar frascos revesti…

Representative Results

É muito importante para iniciar o processo de diferenciação de uma cultura de células de 70% -80% confluente neural progenitor (Figura 1A). Muitas células irão morrer depois de mudar o meio de cultura de células progenitoras para médio oligo uma vez que inclui fatores de crescimento específicos. Isto indica que o crescimento de células progenitoras neurais não comprometidos com um fenótipo oligodendrocytic não serão suportadas pelo meio novo (Figura 1B). A incubação em m…

Discussion

Este protocolo descreve como para derivar a partir de oligodendrócitos fetais humanas primárias células progenitoras neuronais e caracterizar o fenótipo de citometria de fluxo utilizando ambos e coloração por imunofluorescência. A expansão eo crescimento de células progenitoras neurais de SNC fetal foi muito bem descrito ^1-4. No entanto, a obtenção de oligodendrócitos humanos suficientes para experimentação in vitro continua a ser difícil, embora seja possível identificar e i…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final concentration
DME/HAMS F12 1:1	Omega Scientist	DM-251	1X
Bovine Albumin	Sigma	A9418	1%
Gentamicin	Quality Biologicals	120-098-031	50 μg/ml
L-Glutamine	Quality Biologicals	118-084-061	2 mM
T3	Sigma	T2877	3 nM
N2 Components	Gibco BRL	17502	1:100
NT-3	PeproTech Inc	450-03	2 ng/ml
Shh	R&D System	1314-SH/CF	2 ng/ml
bFGF	PeproTech Inc	100-18B	20 ng/ml
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	10 ng/ml
PDL	Sigma	P6407	50 μg/m
PFA	Electron Microscopy Sciences	15712	2%
Trypsin	Quality Biologicals	118-087-721
Papain	Worthington	LK003178	20 U/ml
DNase vials	Worthington	LK003172	0.005%
EBSS	Worthington	LK003188
ProLong Gold with DAPI	Invitrogen	P36931
			Table 1. Reagents.
			Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs Flow Cytometry A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA Immunocytochemistry βIII tubulin (1:1,500) Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA (1:1,000) GFAP (1:1,000) Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA (1:500) MBP (1:50) Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA (1:100) O4 (1:100) Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA (1:100) GalC (1:10) Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA (1:100) Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phycoerythrin; PETR, phycoerythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.