Denna video presentation visar en metod för att skörda de två viktigaste högst vaskulära strukturer som stödjer framhjärnan funktion. De är den cerebrala ytan (ytlig) vaskulatur tillsammans med associerade meninger (MAV) och koroidea plexus som är nödvändiga för cerebralt blodflöde och cerebrospinalvätska (CSF) homeostas.
Denna videopresentation skapades för att visa en metod för att skörda de två viktigaste högst vaskulära strukturer, som inte är bosatta i hjärnan korrekt att stödja framhjärnan funktion. De är den cerebrala ytan (ytlig) vaskulatur tillsammans med associerade meninger (MAV) och koroidea plexus som är nödvändiga för cerebralt blodflöde och cerebrospinalvätska (CSF) homeostas. Vävnaden skördas är lämplig för biokemiska och fysiologiska analys och MAV har visat sig vara känsliga för skador produceras av amfetamin och hypertermi 1,2. Som väl de större och mindre cerebral vasculatures skördats i MAV är potentiellt stort intresse vid utredning concussive typer av skallskada. Den MAV dissekerade i denna presentation består av pial och några av spindelvävshinnan membran (mindre dura) av meningerna och större och mindre cerebral yta kärl. Koroidea plexus dissekerade är den struktur som finns i Lateral ventriklama såsom beskrives av Oldfield och McKinley 3,4,5,6. De metoder som används för att skörda dessa två vävnader underlättar också skörden av regionala kortikal vävnad saknar hjärnhinnorna och större cerebral yta kärlsystemet, och är kompatibel med skörd andra hjärnan vävnader såsom striatum, hypotalamus, hippocampus, etc. dissektion av de två vävnaderna tar 5 till 10 minuter totalt. Genuttrycket nivåer för dissekerade MAV och åderhinnan plexus, som visas och beskrivs i denna presentation finns på GSE23093 (MAV) och GSE29733 (koroidea plexus) vid NCBI GEO förrådet. Dessa data har varit, och är under, för att bidra till att ytterligare förstå funktionen hos MAV och åderhinnan plexus och hur neurotoxiska händelser såsom allvarlig hypertermi och Amph påverka deras funktion.
Tekniska aspekter på MAV och koroidea plexus dissekering
Det är kritisk under dissektion av MAV att hjärnan "nedsänkt" det mesta i normal saltlösning eller natriumfosfat-buffrad saltlösning. Låta MAV och cortex att dehydratisera under dissektion kommer att resultera i MAV vidhäftar tätt till kortikalt skikt I. Detta kommer att öka mängden av kortikal vävnad skördas med MAV och / eller resultera i oförmåga att avlägsna dessa vidhäftande MAV sektioner från cortex. Dessutom är tålamod krävs under dissekering. Återigen, om man stöter visst motstånd i att ta bort MAV från cortex i en hemisfär under dissekering, växla till den andra hemisfären och gå tillbaka senare till sidan där motståndet påträffades. Denna metod tar lite praxis att perfekt och kräver cirka 5 till 15 "praxis" dissektioner innan en konsekvent enhetlig skörd av MAV vävnad uppnås. Sättet att starta dissektionen och Removär av MAV vid arteriella cirkeln vid basen av hjärnan underlättar avlägsnandet av meningerna genom att använda större vaskulatur som stöd "byggnadsställningar."
Mycket av blodet ursprungligen i MAV vaskulaturen efter avlivning ska matas ut under dissektionen, och mindre än 5% av RNA skördas från MAV bör vara av blod ursprung. Det är möjligt att avlägsna nästan allt blod genom perfusion djuret med 50 till 70 ml saltlösning, med användning histologiska tekniker, före dekapitering och hjärnan avlägsnas. Emellertid är det då mycket svårare att visualisera MAV vävnader vid dissekering. De tre mest sannolika källor till "kontaminering" av MAV vävnaderna är tallkottkörteln, kortikal skiktet I vävnad och återstående luktloben vävnad, men det är också möjligt att få hypofysen vävnad i beredningen. Pineal föroreningar i MAV detekteras av MAV innehåller en rund 1 till 2 sfär mm diameter som är färgad mörkt röd. Den primära funktionenav tallkottkörteln normalt anses vara helt annorlunda från Mav. Dess primära funktion är att producera melatonin, som reglerar aspekter av dygnsrytmen 9, och i lipoxygenation 10 av lipid-prekursorer. Även genen Lox, som reglerar lipoxygenasaktivitet, ansågs vara närvarande hos vuxna främst tallkottkörteln 10, våra resultat tyder på att det också är konsekvent närvarande vid signifikanta nivåer i MAV. Resterande kortikala eller luktloben föroreningar resulterar i rosa banliknande MAV vävnad har några 1 till 2 vävnader mm tätare som är mycket blekare i färgen inneslutna i den. Detta kan upptäckas genom "flyter" på MAV på ytan av bufferten, och därefter avlägsna tyngre kortikala eller glödlampa vävnader med de två dissekera pincett.
Om förorening av MAV från kortikal skiktet I vävnad, hypotalamus vävnad eller tallkottkörteln är närvarande, då flera gener kommer att ha en betydandebetydligt högre uttryck än vad som normalt är närvarande i en "ren" dissektion. Kontaminering av MAV med tallkottkörteln kommer att resultera i högre uttryck av arylalkylamin-N-acetyltransferas (AANAT) som är nödvändig för melatonin syntes. Tyvärr, om tallkottkörteln kontaminering sker under MAV dissektion, kommer nivåerna av Lox i MAV inte kunna bestämmas noggrant. Kontaminering av MAV med kortikal vävnad kommer att resultera i högre uttryck av neuron-specifika gener såsom hippocalcin (HPCA), parvalbumin (Pvalb) och / eller neuronal pentraxin receptor (Nptxr). Kontaminering av MAV med hypotalamus vävnad kommer att resultera i högre uttryck av tillväxthormon 1 (GH1), proopiomelanokortin (POMC). I händelse av att någon kontaminering existerar i de skördade vävnader, kan de flesta av dessa gener kan identifieras och inte används i genuttryck analys. Detta är särskilt viktigt för gener som är närvarande i den cirkulerande blood som fortfarande kan finnas i MAV eller plexus koroidea.
Interpretting uppgifter genuttryck från skördad MAV och plexus koroidea
Den cerebrala ytan (ytlig) vaskulatur tillsammans med associerade meninger (MAV) och koroidea plexus är nödvändiga för cerebralt blodflöde och cerebrospinalvätska (CSF) homeostas 4,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Vävnaden skörden är lämplig för biokemiska och fysiologiska analys och MAV har visat sig vara känsliga för skador produceras av amfetamin och hypertermi 1,2 med genuttryck analys. Dessa resultat står i proportion till vad som är också känt om allvarliga hypertermi och exponering för amfetamin till hjärnan kärlsystemet i allmänhet 18,19,20. Kliniska data stöder uppfattningen att den subdural kärlsystemet är känslig för skador av amfetamin och metamfetamin 21,22. Liksom, inklusive de större och mindre cerebrala vasculaturesning de i pial lagret av meningerna som skördats i MAV är potentiellt stort intresse vid utredning concussive typer av skallskada 23,24 25. Den nuvarande genuttryck profil gav från MAV indikerar att pial och eventuellt spindelvävshinnan meningeal membran kan spela en större roll än väntat i regleringen CSF sammansättning. I framtiden, genom användning av dissektionsmikroskop tekniker, kan det vara möjligt att ytterligare separera vävnaderna innefattande MAV så att pial och spindelvävshinnan membran kan separeras från den större arteriella vaskulaturen närvarande och eventuellt från varandra. Detta kommer att möjliggöra en bättre tolkning av funktionen hos var och en av dessa 3 komponenter i skördade MAV.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av NCTR / FDA.
Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Normal Saline (9 grams saline/ 1 Liter H2O) | In-house | Dissection buffer | |
0.1 M Sodium Phosphate pH 7.4 | In-house | Dissection buffer | |
Bone Rongeurs | Roboz | RS-8300 | Skull bone removal |
Forceps-bent tip (4″ long & 0.8 mm wide tip) | Roboz | RS-5135 or RS-5137 | Dissecting forceps |
Forceps-straight tip (5.5″ long ) | Roboz | RS-8124 or RS-8104 | Thumb Dressing forceps |