यह लेख RootChip के Arabidopsis पौध की खेती के लिए एक प्रोटोकॉल, एक microfluidic इमेजिंग मंच है कि सूक्ष्म जड़ निगरानी और intracellular metabolite का स्तर की झल्लाहट आधारित माप के साथ विकास शर्तों के स्वचालित नियंत्रण को जोड़ती है प्रदान करता है.
जड़ संयंत्र की शारीरिक लंगर के रूप में कार्य करता है और नाइट्रोजन, फास्फोरस, सल्फेट, और तत्वों का पता लगाने है कि पौधों को मिट्टी से प्राप्त के रूप में पानी और खनिज पोषक तत्वों के तेज के लिए जिम्मेदार अंग है. यदि हम उच्च फसल की उपज के उत्पादन के लिए स्थायी दृष्टिकोण विकसित करना चाहते हैं, हम बेहतर समझने के लिए कैसे रूट विकास, पोषक तत्वों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम लेता है, और सहजीवी और रोगजनक जीवों के साथ सूचना का आदान प्रदान की जरूरत है. इन लक्ष्यों को पूरा करने के लिए, हम दिन पहले से लेकर समय समय पर सूक्ष्म विस्तार में जड़ों का पता लगाने में सक्षम होने की जरूरत है.
Microfluidic डिवाइस आधारित है, जो हमें बढ़ने और Arabidopsis seedlings से छवि जड़ों की अनुमति देता है, जबकि जड़ों को 1 इमेजिंग (चित्रा 1) के लिए तैयारी के दौरान किसी भी शारीरिक तनाव से बचने हम RootChip, polydimethylsiloxane (PDMS) विकसित. युक्ति एक बंटवारा चैनल के micromechanical वाल्व की विशेषता संरचना द्रव प्रवाह गाइड के शामिलसमाधान inlets से आठ अवलोकन के दो कक्षों में से प्रत्येक के लिए. यह छिड़काव प्रणाली है जड़ microenvironment से नियंत्रित किया जा करने के लिए और सटीक और गति के साथ संशोधित की अनुमति देता है. कक्षों की मात्रा लगभग 400 nl है, इस प्रकार परीक्षण समाधान के केवल न्यूनतम मात्रा की आवश्यकता होती है.
यहाँ हम वास्तविक समय संकल्प के साथ इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण का उपयोग कर RootChip पर जड़ जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. जड़ें कई दिनों से अधिक समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी का उपयोग विश्लेषण किया जा सकता है. जड़ें पोषक तत्व समाधान या inhibitors के साथ perfused किया जा सकता है, और आठ seedlings के समानांतर में विश्लेषण किया जा सकता है. इस प्रणाली को जड़ वृद्धि की उपस्थिति या रसायन, जीन अभिव्यक्ति के प्रतिदीप्ति आधारित विश्लेषण, और biosensors के विश्लेषण के अभाव में विश्लेषण सहित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए क्षमता है, जैसे 3 nanosensors झल्लाहट.
पारंपरिक विकास के तरीकों पर RootChip का मुख्य लाभ माइक्रोस्कोपी के लिए न्यूनतम इनवेसिव तैयारी, reversibly और बार बार रूट वातावरण को बदलने की क्षमता है, और कई दिनों की अवधि में developmentally सक्षम और physiologically स्वस्थ ऊतक के सतत अवलोकन के लिए क्षमता है. इससे पहले, seedlings खड़ी gelled मीडिया पर बड़े हो रहे थे और एक छिड़काव प्रणाली के लिए प्रयोग है, जो केवल एक समय में 8 एकल जड़ों को मापने की अनुमति दी से पहले तुरंत हस्तांतरित. Microfluidic उपकरण Arabidopsis के लिए, लेकिन एक कम एकीकरण स्तर पर 9 या छिड़काव 10 नियंत्रण के बिना इस्तेमाल किया गया है. RootChip सटीक प्रवाह मार्गदर्शन के माध्यम से प्रयोगों को स्वचालित करने की क्षमता के साथ एकीकरण के एक उच्च स्तर को जोड़ती है. इस मंच, सभी microfluidic 11 उपकरणों की विशेषता है, का एक अन्य लाभ है कि तरल के केवल न्यूनतम मात्रा आवश्यक अखरोट के साथ रूट की आपूर्ति के लिए आवश्यक हैंप्रयोगों के लिए भी कई दिनों फैले rients. RootChip वर्तमान में एक एकल उपयोग युक्ति के रूप में बनाया गया है, लेकिन बाद से चिप्स के उत्पादन की लागत कम कर रहे हैं, खपत अभिकर्मकों की छोटी मात्रा में चिप अभी भी बहुत लागत प्रभावी बनाता है.
वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि seedlings के स्वास्थ्य की गारंटी करने के लिए लिया जाना चाहिए रहे हैं:
प्लास्टिक शंकु में मात्रा केवल 3-4 μl है, जो जब हवा के संपर्क सूखी शुरू हो जाएगा. इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि शंकु चिप पर स्थानांतरित कर रहे हैं जल्दी और आर्द्रता उच्च रखा जाता है जब तक जड़ों अवलोकन कक्षों, जो उन्हें पर्याप्त पानी के साथ की आपूर्ति करेगा तक पहुँच चुके हैं. 4,2 करने के लिए 4,5 कदम जल्दी और seedlings के सुखाने को रोकने के लिए रुकावट के बिना किया जाना चाहिए.
3.5 कदम – 3.8 तरल मीडिया के दौरान जो जड़ों अवलोकन कक्षों में बढ़ने में चिप के ऊष्मायन का वर्णन. यह कदम ग में चिप बढ़ते द्वारा छोड़ी नहीं जा सकती हैarrier तुरंत और मध्यम विकास के साथ लगातार छिड़काव शुरू. हालांकि, हम मध्यम विकास में भिगोने रातोंरात सलाह देते हैं, के रूप में यह कुछ फायदे हैं: 1) यह एक आर्द्र वातावरण बनाता है ताकि seedlings के कम शुष्क बन के रूप में वे अवलोकन कक्ष में बढ़ने की संभावना है; 2) चिप तरल में भिगो है, degassing (6.4 कदम) तेजी से हो जाएगा.
यह कम घुला हुआ पदार्थ सांद्रता के साथ मीडिया का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. और अधिक ध्यान केंद्रित समाधान वेग और चैनलों को रोकना हो सकता है, खासकर अगर चिप कई दिनों से अधिक प्रयोग किया जाता है.
एक बार उपकरण हवा के दबाव लाइन से जुड़ा है, माध्यम के प्रवाह के वाल्व में हाइड्रोलिक दबाव को बदलने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. Micromechanical वाल्व का उचित बंद करने की गारंटी, यह महत्वपूर्ण है के लिए एक नियंत्रण दबाव है कि प्रवाह दबाव की तुलना में लगभग तीन गुना अधिक है का चयन करें. प्रवाह दबाव 15 साई से अधिक नहीं के रूप में तरल पदार्थ जड़ inlets के बाहर धक्का दे दिया जाएगा चाहिए. उच्च मा दबाववाई भी चिप है, जो चिप बेकार renders के delamination कारण.
RootChip की एक सीमा है कि PDMS झरझरा और hydrophobic है. जबकि सामग्री जलकृत समाधान के लिए व्यावहारिक रूप से निष्क्रिय है, यह कार्बनिक यौगिकों 12 अवशोषित हो सकता है. यह समाधान के रूप में कार्बनिक यौगिकों सामग्री से रिसाव हो सकता है जब भी इस परिसर की आपूर्ति के प्रवेश पर रोक दिया गया है की एक तेजी से मुद्रा के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. सरंध्रता के कारण, कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग 12 PDMS की सूजन का कारण हो सकता है.
हम RootChip अनुकूलन और फसल पौधों की जड़ों के साथ उदाहरण के लिए, अपनी उपयोगिता का विस्तार जारी है. हम मानते हैं कि उपचार और अवलोकन के लिए रूट करने के लिए उपयोग में सुधार, RootChip तरह microfluidic उपकरणों जड़ अनुसंधान के नए आयाम खुल जाएगा.
The authors have nothing to disclose.
हम फिलिप Denninger वीडियो तैयारी और भावना चौधरी के साथ संयंत्र झल्लाहट सेंसर व्यक्त लाइनों प्रदान करने के लिए मदद के लिए धन्यवाद. यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1021677 MCB), ऊर्जा विभाग WBF, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (de-FG02-04ER15542), और हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल SRQGG संस्थान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया एक EMBO लंबे समय तक के द्वारा समर्थित किया गया फैलोशिप की अवधि. एम.एम. अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Items | Source | Information |
Chip carrier, software and other information. | Carnegie Institution – DPB | CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website. |
RootChip | Stanford Foundry | Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/ |
Chip controller | -home built- | The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers |