生化定义的大单层囊泡（LUVs）是一种便捷的模型系统，可用于分析BCL-2家族蛋白的相互作用，有助于深入理解线粒体介导的细胞凋亡通路。本文介绍了一种制备LUVs的方法，以及用于检测LUVs通透化的标准BCL-2家族蛋白组合和对照体系。
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本文内容
摘要
摘要
BCL-2（B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤）家族由大约二十种蛋白质组成，这些蛋白质协同作用以维持细胞存活或启动细胞凋亡1。在细胞应激（例如，DNA损伤）后，促凋亡的BCL-2家族效应蛋白BAK（BCL-2拮抗性杀伤因子1）和/或BAX（BCL-2相关X蛋白）被激活，并通过线粒体外膜通透化（MOMP）过程破坏线粒体外膜（OMM）的完整性1。MOMP发生后，促凋亡蛋白（例如，细胞色素c）进入细胞质，促进半胱天冬酶（caspase）的活化，从而迅速引发细胞凋亡2。
为了诱导线粒体外膜透化（MOMP），BAK/BAX 需要与 BCL-2 家族另一促凋亡亚群——仅含 BCL-2 同源结构域 3（BH3-only）蛋白（如 BID（BH3 相互作用结构域激动剂））发生短暂相互作用3-6。抗凋亡 BCL-2 家族蛋白（例如，BCL-2 相关基因长亚型 BCL-xL；骨髓细胞白血病蛋白 1，MCL-1）通过严格调控 BAK/BAX 与能够直接激活 BAK/BAX 的 BH3-only 蛋白之间的相互作用，来调节细胞存活7,8。此外，抗凋亡 BCL-2 蛋白的可用性还受到敏感化/去阻遏型 BH3-only 蛋白（如 BAD（细胞死亡的 BCL-2 拮抗剂）或 PUMA（p53 上调的凋亡调节因子））的调控，这些蛋白可结合并抑制抗凋亡成员7,9。由于大多数抗凋亡 BCL-2 家族成员定位于线粒体外膜（OMM），细胞是维持存活还是启动 MOMP 的决策，由此膜上多种 BCL-2 家族成员间的相互作用共同决定。
大单层囊泡（LUVs）是一种生化模型，用于研究BCL-2家族蛋白相互作用与膜通透化之间的关系10。LUVs由明确组成的脂质构成，其比例依据从溶剂提取的非洲爪蟾线粒体中获得的脂质组分研究结果确定（46.5%磷脂酰胆碱、28.5%磷脂酰乙醇胺、9%磷脂酰肌醇、9%磷脂酰丝氨酸和7%心磷脂）10。该模型系统便于直接探究BCL-2家族蛋白的功能，因为其蛋白质和脂质组分完全明确且易于操控，而原代线粒体并不总是具备这些优势。尽管心磷脂在真实的外膜（OMM）中通常不会达到如此高的比例，但该模型仍能真实模拟OMM以促进BCL-2家族蛋白的功能。此外，上述方案的最新改进版本允许对蛋白质相互作用进行动力学分析，并实时测量膜通透化过程，其原理基于含有多阴离子染料（ANTS：8-氨基萘-1,3,6-三磺酸）和阳离子猝灭剂（DPX：p-二甲苯双吡啶溴化物）的LUVs11。当LUVs发生通透化时，ANTS与DPX扩散分离，从而检测到荧光信号增强。本文描述了利用含ANTS/DPX的LUVs进行实验时常用的重组BCL-2家族蛋白组合及对照设置。
方案
1. 混合脂质并制备脂质膜
- 在通风橱内且光照最小的条件下，使用经氯仿冲洗过的 Hamilton 气密玻璃注射器，将溶于氯仿的脂质加入 1.5 ml 棕色玻璃小瓶中。此混合物将得到约 4 mg 脂质（图 1A）。
- 心磷脂 10 mg/ml (CL) - 63 μl
- 磷脂酰胆碱 10 mg/ml (PC) - 84 μl
- 磷脂酰乙醇胺 10 mg/ml (PE) - 125 μl
- 磷脂酰肌醇 10 mg/ml (PI) - 59.5 μl
- 磷脂酰丝氨酸 10 mg/ml (PS) - 65 μl
- 为去除氯仿，向小瓶中通入温和的惰性气体（例如，氮气或氩气）。干燥后，小瓶底部和壁面将出现可见的脂质薄膜，通常需要 2 - 3 小时（图 1A）。
2. 准备脂质体溶液
- 在1.7 ml 微量离心管中，用LUV缓冲液（0.2 mM EDTA、10 mM HEPES [pH 7]、200 mM KCl、5 mM MgCl2 ）配制500 μl 12.5 mM ANTS溶液，以及500 μl 45 mM DPX溶液（图1B）。
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讨论
所述生成大单层囊泡（LUV）的方法提供了一种快速且高效的方式，可在生化定义的膜环境中检测各种BCL-2家族蛋白、多肽及相关试剂的功能，该环境类似于线粒体外膜（OMM）。若采用终点值来测定LUV的通透化程度，可在同一天内设置多块微孔板，以分析数百种不同条件。我们发现，此类实验中的限制性因素通常是重组蛋白的质量和数量，因此投入充足的时间和资源进行蛋白纯化，将有助于获得可重复的LUV实验结果。
根据我们的经验，当大单层囊泡（LUV）在避光条件下于4 °C保存时，通常在两周内仍能对BAX和BID产生响应。然而，重组BCL-2蛋白更不稳定，在多次冻融后其活性可能发生显著变化。我们建议将蛋白储备液以尽可能高的浓度分装成小份，于-80°C保存，并在使用前即刻稀释。这样做可显著提高蛋白的使用效率，并减少实验结果的偶然性。确保检测孔中不存在气泡，因为气泡会导致酶标仪读数错误。此外，去垢剂可能会影响多种BCL-2蛋白的构象以及LUV的完整性，因此需谨慎操作，避免任何潜在的污染12。
关于BCL-2家族及其相互作用蛋白，仍.......
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致谢
我们感谢Chipuk实验室所有成员的同事情谊与支持。此外，我们感谢Tomomi Kuwana和Donald Newmeyer为本研究奠定了实验基础。本研究获得以下资助：NIH CA157740（资助J.E.C.），NIH P20AA017067的试点项目（资助J.E.C.）。本研究还部分得到了March of Dimes基金会研究资助5-FY11-74（资助J.E.C.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 –乙醇胺 "PE" | Avanti | 850725C | |
| L-α-磷脂酰胆碱（鸡蛋，鸡源）"PC" | Avanti | 840051C | |
| L-α-磷脂酰肌醇（肝脏，牛源）"PI" | Avanti | 840042C | |
| L-α-磷脂酰丝氨酸（脑组织，猪源）"PS" | Avanti | 8400320 | |
| 心磷脂（心脏，牛源 - 钠盐）"CL" | Avanti | 840012C | |
| 微型挤出器套装 | Avanti | 610023 | |
| PC膜，0.2 mM | Avanti | 610006 | |
| Costar黑色96孔板 | Fisher Scientific | 07-200-590 | |
| 人源切割型Caspase-8 BID蛋白 | R&D Systems | 882-B8-050 | |
| 人源BCL-xL蛋白（缺失C末端） | R&D Systems | 894-BX-050 | |
| BID/PUMA BH3结构域多肽 | Anaspec | 61711/62404 | |
| Synergy H1杂合多模式微孔板读板仪 | BioTek | None |
参考文献
- Chipuk, J. E., Moldoveanu, T., Llambi, F., Parsons, M. J., Green, D. R. The BCL-2 family reunion. Mol. Cell. 37, 299-310 (2010).
- Green, D. R. Apoptotic pathways: ten minutes to dead. Cell. 121, 671-674 (2005).
- Gavathiotis, E.
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