Kvantitativ analyse av Chromatin Proteomes i sykdom
Summary
Fremskritt innen massespektrometri har tillatt høy gjennomstrømning analyse av protein uttrykk og modifikasjon på en rekke vev. Kombinert med subcellulære fraksjonering og sykdom modeller, kvantitative massespektrometri og bioinformatikk kan avsløre nye egenskaper i biologiske systemer. Metoden er beskrevet her analyserer kromatin-assosierte proteiner i innstillingen av hjertesykdom og er lett anvendelig til andre<em> In vivo</em> Modeller av sykdom hos mennesker.
Abstract
I kjernen bor de proteomes hvis funksjoner er mest nært knyttet genregulering. Voksen pattedyr cardiomyocyte kjerner er unik på grunn av den høye prosentandel av binucleated celler, 1 har den overveiende heterochromatic tilstanden av DNA, og den ikke-delende natur cardiomyocyte som gjengir voksen atomkjerner i en permanent tilstand av interfase. 2 transkripsjonsregulering under utvikling og sykdom har blitt godt undersøkt i dette organet, 3-5, men det er fortsatt relativt uutforsket er den rollen de kjernefysiske proteiner ansvarlig for DNA emballasje og uttrykk, og hvordan disse proteinene styrer endringene i transcriptional programmer som oppstår under sykdom. 6 I den utviklede verden, er hjertesykdom nummer én årsak til dødelighet for både menn og kvinner. 7 innsikt i hvordan kjernefysiske proteiner samarbeide for å regulere utviklingen av denne sykdommen er avgjørende for å fremme den aktuelle behandlingen options.
Massespektrometri er det ideelle verktøy for å håndtere disse spørsmålene som gjør det mulig for en objektiv annotering av den kjernefysiske proteomet og relativ kvantifisering for hvordan overflod av disse proteinene endringer med sykdom. Mens det har vært flere proteomikk studier for pattedyr kjernefysiske protein komplekser, 8-13 inntil nylig 14 har det vært bare en studie som undersøker hjertets kjernefysiske proteomet, og det anses hele kjernen, snarere enn å utforske proteomet på nivået av kjernefysiske sub avdelinger . 15 I stor grad er dette mangel på arbeid på grunn av vanskeligheter med å isolere hjerte kjerner. Cardiac atomkjerner forekommer innenfor en stiv og tett aktin-myosin apparat som de er forbundet via flere forlengelser fra det endoplasmatiske retikulum, i den grad at myocyte sammentrekning endrer deres samlede form. 16 Dessuten cardiomyocytes er 40% mitokondrier volum 17 som Necessitates anrikning av kjernen bortsett fra de andre organeller. Her beskriver vi en protokoll for hjerte kjernefysisk berikelse og videre fraksjonering i biologisk relevante avdelinger. Videre har vi detaljerte metoder for label-fri kvantitativ massespektrometrisk disseksjon av disse fraksjoner-teknikker mottagelig for in vivo eksperimenter i ulike dyremodeller og organsystemer der metabolske merking er ikke gjennomførbart.
Protocol
Representative Results
Discussion
To viktigste metodene for kjernefysisk isolasjon er gjennomgått tidligere: 27 en er Behrens teknikken homogenisere lyofilisert vev i en ikke-vandig løsningsmiddel og andre, er en modifikasjon som vi bruke her, av homogenisering vev i en vandig sukrose / saltoppløsning fulgt av differensial eller tetthet-gradient sentrifugering.
Subfraksjonering av kjernene ved syreekstraksjon på vevsprøver er et viktig verktøy for å studere kromatin som har vært brukt siden 1960, 28</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den Vondriska lab er støttet med tilskudd fra National Heart, Lung and Blood Institute of NIH og Laubisch Endowment ved UCLA. EM er mottaker av Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship i fysiologi ved UCLA, HC er mottaker av en American Heart Association Pre-doc, MP er mottaker av en NIH Ruth Kirschstein post-doc, og SF er mottaker av en NIH K99 Award.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Dulbeco Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965 |
| Protease pellet | Roche | 04 693 159 001 |
| 100 μm strainer | BD Falcon | 352360 |
| Ultracut ultramicrotome | Reichert | |
| 100CX Transmission Electron Microscope |
JEOL USA, Inc. | |
| Oriole | BioRad | 161-0496 |
| Histone H2A antibody | Santa Cruz | sc-8648 |
| Nucleoporin p62 antibody | BD Biosciences | 610498 |
| Adenine nucleotide transporter antibody | Santa Cruz | sc-9299 |
| BiP antibody | Santa Cruz | sc-1050 |
| Tubulin antibody | Sigma | T1568 |
| Histone H3 antibody | Abcam | ab1791 |
| Fibrillarin antibody | Cell Signaling | C12C3 |
| SNRP70 antibody | Abcam | ab51266 |
| E2F-1 antibody | Thermo Fisher | MS-879 |
| Retinoblastoma antibody | BD Biosciences | 554136 |
| Hypoxia inducible factor-1 antibody | Novus Biologicals | NB100-469 |
| BCA protein assay | Thermo Scientific | 23227 |
| Reverse phase column | New Objective | PFC7515-B14-10 |
| BioWorks Browser | Thermo Scientific |
References
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Rumyantsev, P. P. Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration. Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).
- Olson, E. N., Schneider, M. D. Sizing up the heart: development redux in disease. Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).
- Molkentin, J. D., Dorn, G. W. Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy. Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).
- Fishman, M. C., Chien, K. R. Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development. 124, 2099-2117 (1997).
- Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123, e18-e209 (2011).
- Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R., Gerace, L. Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics. Science. 301, 1380-1382 (2003).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Malik, P., et al. Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope. Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).
- Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain. J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).
- Chu, D. S., et al. Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors. Nature. 443, 101-105 (2006).
- Uchiyama, S., et al. Proteome analysis of human metaphase chromosomes. J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).
- Kislinger, T., et al. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
- Moore, D. H., Ruska, H. Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells. J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).
- Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage. J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).
- Franklin, S., et al. Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy. Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).
- Paulsson, A. K., et al. Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy. Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).
- Franklin, S., et al. Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth. Mol Cell Proteomics. 11, (2012).
- Gramolini, A. O., et al. Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses. Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).
- Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels. J. Vis. Exp. (27), e1178 (2009).
- Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics. Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).
- Lomenick, B., et al. Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).
- Kamleh, A., et al. Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).
- Searle, B. C. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies. Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).
- Murray, K. The Basic Proteins of Cell Nuclei. Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).
- Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus. Biochem. J. 77, 631-636 (1960).
- Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications. Nucleic Acids Res. 37, e81 (2009).
- Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues. J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).
- Gronow, M., Griffiths, G. Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei. FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).
- Mischke, B. G., Ward, O. G. Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba. Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).
- Andersen, J. S., et al. Directed proteomic analysis of the human nucleolus. Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).
- Zhao, Y., Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques. Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).
- Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS. Proteomics. 10, 671-686 (2010).
- Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns. Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Mol. Cell Proteomics. , (2012).
- Wu, C., et al. A protease for ‘middle-down’ proteomics. Nat. Methods. , (2012).
- Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480, 254-258 (2011).
