Intraoperatieve Detectie van Subtle endometriose: A Novel Paradigma voor opsporing en behandeling van bekkenpijn geassocieerd met het verlies van peritoneale Integriteit

Summary

Verlies van peritoneale integriteit verschaft een nieuw paradigma te begrijpen en om chronische bekkenpijn bij vrouwen met milde vormen van endometriose en kan gemakkelijk worden gedetecteerd met intraoperatieve instillatie van kleurstof op het moment van laparoscopie.

Abstract

Endometriose is een ziekte die vaak 40 tot 70% van de reproductieve leeftijd vrouwen met chronische bekkenpijn (CPP) en / of onvruchtbaarheid. Het doel van deze studie was het gebruik van een blauwe kleurstof (methyleenblauw) peritoneale oppervlakken vlekken tijdens laparoscopie (L / S) om het verlies van integriteit peritoneale detecteren bij patiënten met bekkenpijn en vermoedelijke endometriose tonen. Veertig vrouwen met CPP en 5 vrouwen zonder pijn werden geëvalueerd in deze pilot studie. Tijdens L / S werd geconcentreerd kleurstof gespoten peritoneale oppervlakken, vervolgens afgezogen en gespoeld met lactaat Ringers oplossing. Gebieden van gelokaliseerde kleurstof opname werden geëvalueerd op de aanwezigheid van zichtbare endometriose. Gebieden van intense peritoneale kleuring werden gereseceerd en een aantal gefixeerd in 2,5% gebufferd gluteraldehyde en onderzocht door scanning (SEM) elektronenmicroscopie. Blauwe kleurstof opname was vaker voor bij vrouwen met endometriose en chronische pijn in het bekken dan de controlegroep (85% versus 40%). Resectie van de blauwe STAIned gebieden geopenbaard endometriose met SEM en verlies van peritoneale cel-cel contact vergeleken met normaal geen vlekken peritoneum. Getroffen peritoneum werd in verband gebracht met zichtbare endometriose implantaten in de meeste, maar niet alle patiënten. Subjectieve pijn werd gemeld bij 80% van de patiënten. Gebaseerd op scanning elektronenmicroscopie, concluderen we dat endometriale cellen zich ook buiten zichtbare implantaten van endometriose en lijken de onderliggende mesothelium verstoren. Subtiele laesies van endometriose kan pijn in het bekken dan ook veroorzaakt door verstoring van peritoneale integriteit, waardoor menstruatie of ovulatie bloed en geassocieerde pijn factoren toegang tot de onderliggende sensorische zenuwen. Volledige resectie van aangedane buikvlies kan een betere lange-termijn behandeling voor endometriose en CPP. Deze eenvoudige techniek lijkt detectie van subtiele of bijna onzichtbare endometriose te verbeteren bij vrouwen met CPP en een minimale visuele bevindingen bij L / S en kan dienen om diagnostische nauwkeurigheid te verheffen voor endometriosebij laparoscopie.

Protocol

1. Selectie van patiënten

1. Vrouwen met chronische pijn in het bekken ondergaan een geschiedenis en een lichamelijk onderzoek.
2. Lokalisatie van de pijn, timing met betrekking tot de menstruele cyclus, verbonden symptomen zoals het prikkelbare darm klachten of blaas klachten worden genoteerd en geregistreerd.
3. Vrouwen die een laparoscopie worden ingestemd voor mogelijke resectie van endometriose en het gebruik van hun weefsels voor onderzoek.

2. Laparoscopische technieken

1. Laparoscopie wordt uitgevoerd met behulp van standaard technieken door middel van een 5 mm navelstreng poort en extra 5 mm havens in de onderbuik.
2. Zorgvuldige controle van de bekken wordt uitgevoerd om de bevindingen van endometriose correleren met de pre-operatieve lokalisatie van pijn, zoals aangegeven door de patiënt.
3. Methyleenblauw kleurstof wordt gemengd 1:200 met een steriele zoutoplossing en geïnjecteerd op het bekken oppervlakken met behulp van een aspiratie naald.
4. Afzuiging irrigatie wordt uitgevoerd om de overmaat te verwijderenverven en spoel de peritoneale oppervlakken.
5. Het bekken wordt geïnspecteerd en de gebieden van de blauwe kleurstof opname worden vastgelegd.
6. Indien mogelijk, wordt resectie van de aangedane delen van peritoneum uitgevoerd.

3. Scanning Electron Microscopy

1. Peritoneale secties worden gehecht aan een steriele telfa board het model plat en oriëntatie (intraperitoneaal boven) houden en in gluteraldehyde fixatief (Sigma, St. Louis, MO) voor SEM.
2. Monsters werden georiënteerd en post-gefixeerd in 1% gebufferde osmiumtetroxide gedurende 1 uur en gedehydrateerd met een sequentiële ethanolconcentraties.
3. Monsters werden gedroogd met behulp van vloeibare kooldioxide en gemonteerd op aluminium rasterelektronenmicroscoop stubs met colloïdaal zilver pasta en verstuiving bekleed met goud platina legering tot een dikte van 20 nM.
4. Scanning electronen microscopie werd uitgevoerd met een JEOL JSM-6400 Model scanning microscopie microfoto verkregen uit 12 willekeurige gebieden.

Representative Results

Een voorbeeld van subtiele endometriose dat bijna onzichtbaar is in figuur 1A. Voordat de blauwe kleurstof een onregelmatig gebied gestippelde peritoneum werd gewaardeerd geholpen door reflectie van de laparoscopische licht. In Figuur 1B, het uiterlijk van hetzelfde gebied na kleuring toont hetzelfde onregelmatige patroon over de blaas (Figuur 1B). Zodra dit gedeelte van peritoneum werd gereseceerd (figuur 1C) werd onderworpen aan SEM waaruit bleek bovenliggende endometriumcellen en verstoring van de cel-cel contacten van de onderliggende mesothelium. Normaal peritoneum van een niet-blauwe vlek toont intacte cel-cel contacten en geen endometriotic cellen aanwezig (figuur 1D). In een andere vrouw met CPP en de diagnose interstitiële cystitis (IC), werd geen duidelijke endometriose gezien vóór de toepassing van blauwe kleurstof (figuur 1E). Bij toepassing van kleurstof, de blaas vertoondevoor de hand liggende blauwe kleuring (Figuur 1F). Haar symptomen van CPP en IC sterk verbeterd dan 6 maanden met resectie van deze gebieden blauwgekleurde peritoneum, ondanks het feit dat geen endometriose visueel waargenomen. Endometriose werd gezien op pathologieverslag van links uterosacrale biopsie echter.

Zoals getoond in Tabel 1, van 40 patiënten met CPP vonden we kleuring in 34 MB (85%) vergeleken met 2/5 (40%) van vrouwen zonder CPP. De leeftijd was vergelijkbaar in gevallen versus gecontroleerd en stadium van endometriose gevonden. Blauwe kleurstof opname werd waargenomen in de meeste monsters met endometriose en slechts 2/5 van vrouwen zonder zichtbare endometriose. Endometriose is sterk geassocieerd met de lokalisatie van de blauwe kleurstof. Subjectief werd pijnverlichting gemeld worden verbeterd meerderheid patiënten (32/40, 80%), met uitzondering vrouwen zonder zichtbare endometriose.

Figuur 1. Voorbeelden van laparoscopische bevindingen vóór het aanbrengen van blauwe kleurstof wordt in (A) en (E) in twee vrouwen met CPP, zowel blaasklachten die verergerd ten tijde van de menstruatie. In (A), net reflectie van laparoscopische licht toonde gebieden verdacht voor een duidelijke laesies van endometriose (pijlen). Blauwe kleurstof aangebracht op deze plaatsen gekleurd verschillende gebieden van de blaas (B (pijlen), en F). Resectie van de getroffen peritoneum werd onderzocht door scanning elektronenmicroscopie (SEM). In het monster weggesneden van de blaas (C), kan een enkele laag van endometriose cellen zichtbaar bovenop de peritoneum door scanning elektronenmicroscopie (SEM) (D). De mesotheelcellen van het peritoneum hebben hiaten in hun cel-cel contacten bloot onderliggende extracellulaire matrix. In een geval van een normale buikvlies zonder blauwe kleurstof vlekken, these cellen goed zijn aangesloten zoals in (G). Grootte bars voor SEM zijn opgenomen rechtsonder (D en G). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Parameter	Gevallen (n = 40)	Controles (N = 5)	* Significantie (p <0,05)
Leeftijd (gemiddelde ± SD)	30,17 ± 4,65	32,0 ± 2,55	p = 0,39
Age van Stage O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	33,16 ± 3,82 29,2 ± 4,85 32,0 ± 3,03	N / A
MB Opname O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(34/40) 85% (2/6) 33,3% (28/29) 96,5% (4/5) 80%	(2/5) 40%	p = 0,2
MB bijbehorende w / endometriose O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(0/6) 0% (28/29) 96,5% (5/5) 100%	N / A
Subjectieve Pain Relief	(32/40) 80%	N / A
Hulp van de Pijn door Stage (%) O (n = 6) I-II (n = 29) III-IV (n = 5)	(1/6) 16,7% (27/29) 93,1% (4/5) 80%	N / A

Tabel 1. Ervaring met blauwe kleurstof kleuring in vrouwen met chronische pijn in het bekken.

• Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met Pearson chi kwadraat test.

Discussion

Chronische pijn in het bekken bij vrouwen is een kostbare en slecht begrepen probleem ^1. Dysmenorroe is de meest voorkomende vorm van pijn in het bekken van invloed zijn 60% van de vrouwen ² en 72% van de adolescenten tussen ^3. Endometriose is een inflammatoire aandoening die 5% van de normale vrouwen treft, maar aanwezig in tot 70% van vrouwen met bekkenpijn. Terwijl endometriose draagt ​​bij aan chronische pijn in het bekken (CPP), een mechanisme waardoor letsels veroorzaken pijn blijft onzeker ^4. Paradoxaal genoeg is de ernst van de pijn niet correleren met de ernst van de endometriose ^5,6. Chronische pijnklachten inbegrip van de bijbehorende prikkelbare darm syndroom (IBS) en IC kan niet gediagnosticeerde gaan al jaren ^7,8. De geschatte kosten van endometriose is meer dan $ 22 miljard in de VS alleen al ^9, hoewel waar de boekhouding is moeilijk te beoordelen, omdat endometriose geassocieerd is met andere chronische ziekten zoals migraine, chronische vermoeidheidssyndroom, IBS en IC ^10,11. Oprichting van een diagnose voor endometriose vereist laparoscopie, maar deze ziekte is vaak gediagnosticeerd laat ^12. Onenigheid over wat als endometriose en een gebrek aan gespecialiseerde opleiding draagt ​​bij tot een vertraagde detectie ^13. Eenmaal gevisualiseerd kunnen niet alle verdachte laesies worden gecontroleerd door een patholoog ¹⁴ en in veel gevallen van CPP, endometriose wordt niet op prijs gesteld ^15, misschien te wijten aan subtiele of onzichtbare vormen van de ziekte ^16-19. Het is duidelijk dat een nieuw paradigma nodig is om deze kloof tussen klinische symptomen van pijn en onze diagnostische aanpak voor deze belangrijke ziekte aan te pakken.

Terwijl zenuwbanen die betrokken zijn in de etiologie van pijn in het bekken in verband met endometriose worden steeds vaker onderzocht ^{20 tot 25} verrassende weinig bekend over de manier waarop milde endometriose bijdraagt ​​aan gelokaliseerde chronische pijn in het bekken (CPP). Chirurgische en medische behandeling vaak niet aan te pakken in verband de pijnmet deze aandoening ⁴ en herhaling is gemeenschappelijk. Op basis van studies die in dit onderzoek hebben we veronderstellen dat gelokaliseerde, repetitieve menstruatie en premenstrueel bekkenpijn geassocieerd met endometriose waarschijnlijk is te wijten aan een verstoring in peritoneale integriteit, secundair aan bovenliggende endometriose. Inflammatoire cytokines en bloed in de peritoneale holte van endometriose patiënten zouden direct toegang tot de onderliggende weefsels geïnnerveerde bekken op punten van peritoneale verstoring. Hoewel substantie P is gemeten en niet bevonden anders endometriose patiënten versus controles ^26, TNF-α en glycodelin twee kandidaten die zijn geassocieerd met pijn in endometriose patiënten ^27. Terwijl zenuwvezels zijn beschreven in endometrium en endometriose ^25,28-30 deze bevindingen niet verklaren gelokaliseerde pijn geassocieerd met subtiele of minimale ziekte.

Rapporten het gebruik van methyleen blue dateren uit 1994, toen Manhes het nut ervan gemeld bij het ​​identificeren van subtiele vormen van endometriose ^31. Methyleenblauw kleurstof niet FDA goedgekeurd voor de detectie van endometriose en daarom wij erkennen dat een off-label gebruik van dit product vormt. We hebben gebruik gemaakt methyleenblauw kleuring van het buikvlies te identificeren subtiele of anderszins onzichtbare endometriose (Lewis en Lessey Abstract AAGL / AGES Brisbane, Australië 2008) te helpen. Onlangs, Rauh-Hain en Laufer gemeld een soortgelijk gebruik van indigokarmijn om subtiele vormen van deze ziekte ³² op te sporen. In onze ervaring, is indigokarmijn kleurstof niet uitvoeren van dezelfde en bij sommige patiënten maakt geen vlekken gebied van endometriose die MB herkent. De basis van kleurstof opname kan worden geassocieerd met ontwrichting van epitheliale oppervlakken, zoals in de rat model blaas door Morrison ^22. Hier rapporteren wij voor het eerst aangetoond dat opname van peritoneale kleurstof wordt geassocieerd met mesothelial verstoring en bijbehorende subtieleof onzichtbare endometriose door scanning elektronenmicroscopie. Daarnaast merken wij op dat de gebrandschilderde peritoneale oppervlakken bleek te correleren met de pre-assessment lokalisatie van de pijn bij vrouwen met CPP. Bijvoorbeeld als een patiënt dat haar pijn karakteristiek aan de rechterkant, dat de zijde we meestal zien blauw kleuring. Verder vonden we een significante verbetering in de postoperatieve pijn verslagen in een meerderheid van patiënten bij wie deze peritoneale laesies gereseceerd of geablateerd. We geloven dat deze eenvoudige techniek betere diagnostische nauwkeurigheid voor de identificatie van subtiele endometriose mogelijk terwijl tegelijkertijd een volledige behandeling van de endometriose geassocieerd met CPP. De paradoxale gebrek aan samenhang tussen het stadium van endometriose en de perceptie van pijn kan uiteindelijk worden begrepen in termen van peritoneale gebreken die veel verder reiken dan de zichtbare laesie van endometriose.

Chirurgische behandeling resulteert vaak in symptomatologietic verbetering ^33,34, maar 40 tot 50% van de vrouwen die een behandeling ondergaan hebben onvolledige verlichting of een snelle herhaling van hun symptomen ^35,36. Onzichtbare endometriose of subklinische vormen van de ziekte zijn beschreven ^16-19,37. Daarom kan heel subtiel of enkele cellaag endometriose niet gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd, wat leidt tot een verkeerde diagnose van CPP patiënten en gemiste kansen om pijn te verlichten.

Buikvlies is een onder-bestudeerde gebied van de biologie met slechts een paar papieren die de biologie van peritoneale genezing ³⁸ te beschrijven. Modellen voor peritoneale-endometrium-interactie te bestuderen hebben aangetoond belofte ^{39 tot 43.} Zoals eerder getoond door Witz ^42, vonden we dat endometriale cellen aanwezig die peritoneale zijn geassocieerd met peritoneale cel-cel verstoring. Met explantaten van humane peritoneum en geïsoleerd endometrium epitheliale en stromale cellen Witz en collega's aangetoond dat endometriumcellen gemakkelijkzich aan peritoneale mesothelium ⁴² en dringen door het mesothelium in 18 tot 24 uur ^44. In vivo, we dat endometriale cellen aan het buitenoppervlak van peritoneum hechten zonder blijkbaar invasie. Zo kunnen niet-binnendringende oppervlak endometriosis een stabiel en hardnekkige vorm van endometriose. Oppervlak "rood" laesies kunnen lijken en zijn erkend als een biologisch actieve vorm van endometriose ^45.

Koks beschreven hechting en spreiding van menstruele cellen alleen voor de gebieden van peritoneum die werden beschadigd of afwezig ^46, maar de verdere werkzaamheden van deze groep stelde voor oplosbare factoren veroorzaakt mesotheelcellen celscheiding, vergelijkbaar met wat we waargenomen ^47, met inbegrip van "retractie, krimpen en kloof vorming ". Terwijl hun studie en de latere studie van Witz ⁴⁰ geconcludeerd dat verstoring toegestaan ​​voor sites van adhesie en invasie, onze bevindingen van hiaten in de mesothelium van patiënten met endometriosis geassocieerd met MB absorptie suggereert dat endometriose letsels ver verspreid van de initiële laesie en verstoren het oppervlak buikvlies zonder invasie. Bekende disruptors van cel-cel contact uitgedrukt endometrium of endometriose omvatten TNF-α ⁴⁸ en Efrine A1 ^49,50.

Resectie of ablatie van de MB lood buikvlies is nog niet de standaard van zorg voor endometriose en CPP. Indien dergelijke gebieden peritoneum in feite bedekt met microlagen van endometriose cellen, kan het gebruik van kleurstof technieken om getroffen gebieden kan de diagnostische nauwkeurigheid voor endometriose te verbeteren en zorgen voor een meer volledige resectie van anders onzichtbaar implantaten. In deze voorstudie van CPP voor en na de operatie, we overigens dat de meeste patiënten verbetering in pijn symptomen gemeld. Hurd stelde drie criteria worden gebruikt om de associatie tussen pijn en endometriose te bewijzen: 1) dat de pijn cyclisch, 2) dat endometriosis worden gediagnosticeerd bij laparoscopie en 3) dat medische of chirurgische therapie verbetert de pijn ^51. Terwijl verdere validatie nodig is om onze bevindingen te bevestigen, de vereniging van minimale ziekte, CPP en peritoneale defecten passen bij de Hurd criteria en biedt een nieuwe manier van denken over de evaluatie en behandeling van pijn in het bekken in verband met endometriose. Dit onderzoek werd beperkt door het gebrek aan een formele pijn survey. Toekomstige studies worden nu gepland om gevalideerde pijn in het bekken onderzoeken en visuele analoge schalen (VAS) te gebruiken voor en na de operatie om de lange-termijn oplossing van pijn te kwantificeren bij deze vrouwen met subtiele endometriose en CPP behandeld met resectie van blauw-kleuring gebieden die verband houden met endometriose.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylene blue	American Reagent	NDC0517-0310-110	Mixed 1:200 in saline