के प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping के लिए एक सरल प्रोटोकॉल<em> प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emएक संसाधन गरीब सेटिंग में> संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स
Summary
इस विधि के प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को फेनोटाइप जांच<em> प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम</emचिकित्सीय आइसोलेट्स में> संक्रमित एरिथ्रोसाइट्स (pRBC). इस प्लेटलेट से भरपूर प्लाज्मा और pRBC के निलंबन अलग और सह incubating द्वारा किया जाता है.
Abstract
P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम सीधे क्षेत्र में चिकित्सीय आइसोलेट्स में pRBC का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को परख का वर्णन किया है. प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping, पी. में एक विशेषता व्यवहार फाल्सीपेरम चिकित्सीय आइसोलेट्स, CD36 बाध्यकारी आइसोलेट्स 12,23-24 में अक्सर एक अलग चिपकने वाला फेनोटाइप, के रूप में पहचान की गई है. 1) पी. के इन विट्रो clumping phenotype में एक मजबूत: हम तीन मुख्य बिंदुओं की पहचान करने के लिए इस परख का इस्तेमाल किया है फाल्सीपेरम रोग की गंभीरता और निदान 2) CD36, 3 के साथ एक साथ प्लेटलेट्स पर clumping उपन्यास रिसेप्टर पी selectin mediaties) मुख्यमंत्री के साथ रोगियों में मौजूद थ्रोम्बोसाइटोपेनिया की डिग्री के साथ जुड़ा हुआ है कि मलावी बच्चों से अलग में pRBC झुरमुटों के आगे गठन को सीमित करने के लिए पर्याप्त है इन विट्रो 12. पेड़ों का झुरमुट गठन में प्लेटलेट्स की भागीदारी की धारा 6 में वर्णित के रूप में एक गीला स्लाइड तैयारी का परीक्षण करके प्रदर्शन किया है. प्लेटलेट्स उच्च गति पर centrifugation द्वारा पीआरपी से अलग किया जा सकता हैरक्त समूह प्रतिजनी प्रतिक्रियाओं कम करने के लिए, लेकिन, हम अत्यधिक से निपटने से और उच्च गति centrifugation से समय से पहले प्लेटलेट सक्रियण कम करने के लिए पूरे पीआरपी का इस्तेमाल किया. प्लेटलेट गतिविधि कमजोर प्लेटलेट एगोनिस्ट, एपिनेफ्रीन या के रूप में 26 में वर्णित adenosine diphosphate (ADP) 25 का उपयोग कर प्लेटलेट एकत्रीकरण परीक्षण द्वारा मापा जा सकता है.
पहले से खराब होती गई है कि परख के कई पहलुओं, पीआरपी स्रोतों और परख के परिणाम पर खून प्रतिजन समूहों के प्रभाव के चयन के महत्व जा रहा है उनमें से एक हैं. हम रक्त समूह हे थे जो व्यक्तियों से पीआरपी तैयार + और कुछ दवाइयों प्लेटलेट व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में रक्त तैयार करने से पहले पिछले 7-10 दिनों में किसी भी दवा से नहीं लिया था.
सफलता clumping को प्रभावित कर सकता है कि अन्य कारकों pRBC हेमाटोक्रिट, parasitaemia स्तर और clumping को परख की लंबाई में शामिल हैं. उच्च hematocrit और प्लेटलेट सह का उपयोगयह क्लस्टर सही मायने में एक पेड़ों का झुरमुट है या वे घनी 15 पैक कर रहे हैं क्योंकि चाहे भी कई कोशिकाओं महज एक साथ बैठे हैं कि क्या बताना मुश्किल होगा unt. Clumping भी आम तौर पर लंबे समय तक ऊष्मायन समय के साथ बढ़ जाती है. ये clumping अध्ययन डिजाइन पर विचार किया जाना चाहिए कि सभी उपयोगी दिशा निर्देश हैं.
हम विभिन्न नैदानिक समूहों से नमूने कि ऐसा करना संभव है यदि समानांतर ही दाता से पीआरपी का उपयोग करने में विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन इस तरह के क्षेत्र स्थलों के रूप में सीमित संसाधन सेटिंग में आधान पूल आम तौर पर सीमित है कि लगता है. यह assays के मानकीकरण के लिए एक एकल ओ + दाता है इसलिए मुश्किल है. इसलिए हम जहाँ भी संभव रक्त समूह संगतता सुनिश्चित करने के लिए कई ओ + दाताओं की पहचान की. रक्तदान का बोझ है कि केवल एक व्यक्ति पर गिर नहीं करता है तो कई दाताओं का प्रयोग भी बड़े नमूने आकार के मामलों में उपयोगी है.
एक एकल पे अगर 15-20 मिनट पर नमूना अंक और अधिक व्यावहारिक हैंrson गीला स्लाइड की तैयारी के लिए अनुमति देता है और अतिव्यापी नमूने बार बिना परख कैनेटीक्स प्रदर्शन, assays का आयोजन होता है. सूक्ष्म डेटा के अधिकांश दृश्य और कुछ हद तक मुद्दा नहीं है, इसलिए यह सेल गिनती एक से अधिक व्यक्ति द्वारा सत्यापित है कि महत्वपूर्ण है. उस मामले में, एक समय में एक नमूना से निपटने के व्यक्तिगत दक्षता के आधार पर 3-4 नमूने एक दिन का पूरा विश्लेषण अनुमति दे सकते हैं.
प्लेटलेट की मध्यस्थता clumping को नैदानिक और प्रयोगशाला आइसोलेट्स दोनों का उपयोग किया जा सकता है. प्रयोगशाला लाइनों के लिए, यह CD36 बाध्यकारी परजीवी clumping को आवृत्तियों को अधिकतम करने के लिए उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है. परख ऐसे rosetting या pRBC बंधन, इस phenotype की एक खराब समझ और जांच पहलू मध्यस्थता कर सकते हैं कि प्लेटलेट्स पर रिसेप्टर्स के अध्ययन में सक्षम होगा कि निषेध assays के clumping में इस्तेमाल के रूप में अन्य समूहन assays के साथ मिलकर किया जा सकता.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम वेलकम ट्रस्ट से धन के द्वारा ही संभव बनाया गया था. जेएम (080,964) और SCW (080,948) एक मलावी-लिवरपूल वेलकम ट्रस्ट छात्रवृत्ति द्वारा वेलकम ट्रस्ट फैलोशिप और डीटी द्वारा समर्थित थे.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
| Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
| Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
| 1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
| Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
| Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
| Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
| Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
| Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |
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