Denne metode undersøger blodplade-medieret sammenklumpning fænotype<em> Plasmodium falciparum</em>-Inficerede erytrocytter (PRBC) i kliniske isolater. Dette udføres ved at isolere og co-inkubere blodpladerigt plasma og en suspension af PRBC.
P. falciparum forårsager de fleste alvorlige malariainfektioner. De patofysiologiske mekanismer bag cerebral malaria (CM) er ikke fuldt forstået, og flere hypoteser er blevet fremsat, herunder mekanisk obstruktion af mikrokar af P. falciparum-parasitized røde blodlegemer (PRBC). I løbet af de intra-erythrocytiske stadie af sin livscyklus, P. falciparum har den unikke evne til at modificere overfladen af den inficerede erythrocyt ved at eksportere overfladeantigener med varierende klæbende egenskaber på RBC membranen. Dette tillader beslaglæggelse af PRBC i flere væv og organer ved adhæsion til endotelceller foring microvasculature af post-kapillære venules 1.. Ved at gøre dette, undgå de modne former af parasitten milten clearance af de deforme inficerede erytrocytter 2 og begrænser deres omgivelser til et gunstigere lavt ilt tryk 3.. Som en konsekvens af denne sequestration, er det kun umodne ukønnede parasitter og gametocytter, som kan påvises i det perifere blod.
Cytoadherence og binding af modne PRBC til de mange vært receptorer udtrykt på mikrovaskulære senge forekommer i svær og ukompliceret sygdom. Men flere linjer af beviser tyder på, at kun specifikke klæbende fænotyper vil sandsynligvis være forbundet med alvorlige patologiske resultater af malaria. Et eksempel på sådanne specifikke vært-parasit interaktioner er blevet påvist in vitro, hvor evnen af intercellulært adhæsionsmolekyle-1 at støtte binding af PRBC med bestemte klæbeegenskaber har været knyttet til udviklingen af cerebral malaria 4,5. Moderkagen er også blevet anerkendt som en lokalitet af præferentiel PRBC akkumulering i malaria-inficerede gravide kvinder med chondrotin sulfat A udtrykt på syncytiotrophoblasts som linje placenta intervillous plads som den vigtigste receptor 6.. Rosetdannelse af PRBC to inficerede erytrocytter via komplement-receptor 1 (CD35) 7,8 er også blevet forbundet med alvorlig sygdom 9..
En af de mest nyligt beskrevet P. falciparum cytoadherence fænotyper er evnen til PRBC til dannelse blodplade-medierede klumper in vitro. Dannelsen af sådanne PRBC klumper kræver CD36, et glycoprotein udtrykt på overfladen af blodplader. Andet humane receptor, gC1qR/HABP1/p32, udtrykkes på forskellige celletyper, herunder endotelceller og blodplader, har også vist sig at lette PRBC vedhæftning på blodplader at danne klumper 10. Hvorvidt sammenklumpning sker in vivo er fortsat uklart, men det kan tage højde for den betydelige akkumulering af blodplader er beskrevet i hjernen microvasculature af Malawi børn, der døde fra CM 11. Desuden isolere evne kliniske kulturer til at klumpe in vitro var direkte forbundet med sygdommens alvorlighed i malawianske 12 </sup> Og mozambiquiske patienter 13, (men ikke i malisisk 14).
Med flere aspekter af PRBC sammenklumpning fænotype dårligt karakteriseret har igangværende undersøgelser om dette emne ikke fulgt en standardiseret procedure. Dette er et vigtigt problem på grund af den kendte høje variabilitet iboende i assayet 15.. Her præsenterer vi en metode til in vitro trombocyt-medieret sammenklumpning af P. falciparum med håber, at det vil give en platform for en konsekvent metode til andre grupper og øge kendskabet til de begrænsninger i at undersøge denne fænotype i fremtidige studier. Være baseret i Malawi, leverer vi en protokol specielt designet til en begrænset ressource indstilling, med den fordel, at frisk indsamlede kliniske isolater kan undersøges for fænotype uden behov for nedfrysning.
Vi har beskrevet en blodplade-medieret sammenklumpning assay anvendes til at studere PRBC i kliniske isolater direkte i marken. Blodplade-medieret sammenklumpning, en karakteristisk opførsel i P. falciparum kliniske isolater, er blevet identificeret som en særskilt klæbende fænotype hyppige i CD36-bindende isolater 12,23-24. Vi har brugt denne analyse til at identificere tre hovedpunkter: 1) en stærk in vitro sammenklumpning fænotype af P. falciparum isoleret fra Malawi børn, der er forbundet med sygdommens sværhedsgrad og diagnosticering 2) hidtil ukendte receptor P-selectin mediaties sammenklumpning på blodplader sammen med CD36, 3) graden af trombocytopeni stede hos patienter med CM er tilstrækkelig til at begrænse yderligere dannelse af PRBC klumper i vitro 12.. Inddragelsen af blodplader i klump formation demonstreres ved at undersøge en våd-slide præparat som beskrevet i afsnit 6. Blodplader kan isoleres fra PRP ved centrifugering ved høje hastighederfor at minimere blodgruppe antigene reaktioner, men vi brugte hele PRP for at minimere for tidlig blodpladeaktivering fra overdreven håndtering og fra højhastigheds-centrifugering. Blodplade aktivitet kan måles ved blodpladeaggregering test med svage blodplade agonister epinephrin eller adenosindiphosphat (ADP) 25 som beskrevet i 26..
Der er flere aspekter af analysen, der tidligere har været dårligt karakteriserede, en af dem er vigtigheden af at vælge PRP kilder og effekten af blod antigen grupper om resultatet af analysen. Vi forberedte PRP fra personer, der var blodtype O + og ikke havde taget nogen medicin i de sidste 7-10 dage, før der trækkes blod, da nogle lægemidler kan påvirke blodplader adfærd.
Andre faktorer, der kan påvirke sammenklumpning succes omfatte PRBC hæmatokrit, parasitæmi niveauer, og længden af den sammenklumpning analysen. Ved hjælp af high hæmatokrit og blodplader coUNT ville det være vanskeligt at sige, om klyngen er virkelig en klump, eller om for mange celler blot sidder sammen, fordi de tætbefolkede er pakket 15.. Sammenklumpning også generelt stiger med længere inkubationstider. Disse er alle nyttige retningslinjer, der bør overvejes, når designe sammenklumpning studier.
Vi finder, at prøver fra forskellige kliniske grupper kan analyseres parallelt med PRP fra samme donor, hvis det er muligt at gøre det, men i begrænset ressource indstillinger såsom marken sites transfusion puljen er generelt begrænset. Det er derfor vanskeligt at have en enkelt O + donor at standardisere assays. Vi har derfor identificeret flere O + donorer for at sikre blodtype kompatibilitet muligt. Brug af flere donorer er også nyttigt i tilfælde af store prøver størrelser, så byrden af bloddonation ikke falder på kun én person.
Prøvetagningssteder på 15-20 min er langt mere realistisk, hvis en enkelt person udfører analyserne, der giver mulighed for wet-præparede og udførelse assay kinetik uden prøvetagningstidsrum overlappende. De fleste af de mikroskopiske data visuel og noget mål; derfor er det vigtigt, at celletælling verificeres ved mere end én person. I så fald kan håndtere en prøve på et tidspunkt tillader komplet analyse på tre til fire prøver om dagen, afhængigt af personlig effektivitet.
Blodplade-medieret sammenklumpning kan udføres ved hjælp af både kliniske og laboratoriemæssige isolater. Til laboratorie linjer, anbefales det, at CD36 bindende parasitter bruges til at maksimere sammenklumpning frekvenser. Assayet kan kobles med andre agglutineringsassays såsom rosettering eller anvendes i sammenklumpning inhiberingsassays som kan muliggøre studiet af receptorer på blodpladerne, der kan mediere PRBC binding, en dårligt forstået og undersøgt aspekt af denne fænotype.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev muliggjort af støtte fra Wellcome Trust. JM (080.964) og SCW (080.948), blev støttet af Wellcome Trust stipendier og DT af en Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |