Denne metoden undersøker blodplater-mediert klumper fenotype av<em> Plasmodium falciparum</em>-Infiserte erytrocytter (PRBC) i kliniske isolater. Dette blir utført ved å isolere og co-inkubering av blodplate-rikt plasma, og en suspensjon av PRBC.
P. falciparum forårsaker de fleste alvorlige malaria infeksjoner. De patofysiologiske mekanismene bak cerebral malaria (CM) er ikke fullt ut forstått, og flere hypoteser har blitt lagt frem, herunder mekanisk obstruksjon av microvessels av P. falciparum-parasitized røde blodceller (PRBC). Faktisk, i løpet av den intra-erythrocytic stadium av sin livssyklus, P. falciparum har den unike evne til å modifisere overflaten av den infiserte erytrocytter ved å eksportere overflateantigener med varierende adhesive egenskaper på RBC membran. Dette gjør beslaglegging av PRBC i flere vev og organer ved vedheft til endotelceller lining microvasculature av post-kapillære venules en. Ved å gjøre dette, de modne former av parasitten unngå splenic klarering av deformert infiserte erytrocytter to og begrense deres miljø til en mer gunstig lavt oksygentrykk tre. Som en konsekvens av dette Sequestrasjon, er det bare umodne aseksuelle parasitter og gametocytes som kan oppdages i perifert blod.
Cytoadherence og lagring av modne PRBC til de mange vert reseptorer uttrykt på mikrovaskulære senger forekommer i alvorlig og ukomplisert sykdom. Men flere linjer av bevis tyder på at bare bestemte selvklebende fenotyper er sannsynlig å bli assosiert med alvorlige patologiske utfall av malaria. Et eksempel på slike spesielle vert-parasitt interaksjoner er blitt påvist in vitro, hvor evnen av intercellulære adhesjonsmolekyl-1 for å støtte binding av PRBC med bestemte adhesive egenskaper har vært knyttet til utvikling av cerebral malaria 4,5. Morkaken har også blitt anerkjent som et område av fortrinnsrett PRBC akkumulering i malaria-infiserte gravide kvinner, med kondroitinsulfat En uttrykt på syncytiotrophoblasts som linje placenta intervillous plass som den viktigste reseptoren seks. Rosetterende av PRBC to friske erytrocytter via komplement reseptor 1 (CD35) 7,8 har også vært forbundet med alvorlig sykdom ni.
En av de mest nylig beskrevet P. falciparum cytoadherence fenotyper er evnen til å danne PRBC blodplate-mediert klumper in vitro. Dannelsen av slike klumper PRBC krever CD36, et glykoprotein som uttrykkes på overflaten av blodplater. En annen human reseptor, gC1qR/HABP1/p32, uttrykt på forskjellige celletyper, inkludert endotelceller og blodplater, har også vist seg å lette PRBC adhesjon på trombocytter å danne klumper 10. Enten klumper oppstår in vivo er fortsatt uklart, men det kan forklare den betydelige opphopning av blodplater beskrevet i hjernen microvasculature av malawiske barn som døde av CM 11. I tillegg er det muligheten av klinisk isolat kulturer til å klumpe seg in vitro ble direkte knyttet til alvorlighetsgraden av sykdommen i Malawian 12 </sup> Og mosambikiske pasienter fra 13, (men ikke i maliske 14).
Med flere aspekter av PRBC klumper fenotype dårlig karakterisert, har nyere studier om dette temaet ikke fulgte en standardisert prosedyre. Dette er en viktig sak på grunn av den kjente høy variabilitet iboende i analysen 15. Her presenterer vi en fremgangsmåte for in vitro blodplate-mediert klumping av P. falciparum med håp om at det vil gi en plattform for en konsekvent metode for andre grupper og bevisstgjøring av begrensningene i å undersøke denne fenotypen i fremtidige studier. Være basert i Malawi, gir vi en protokoll spesielt designet for en begrenset ressurs setting, med den fordelen at fersk innsamlede kliniske isolater kan bli undersøkt for fenotype uten behov for nedfrysing.
Vi har beskrevet en blodplate-mediert klumper test som benyttes for å studere PRBC i kliniske isolater direkte i feltet. Blodplater-mediert klumper, en karakteristisk atferd i P. falciparum kliniske isolater, har blitt identifisert som en distinkt lim fenotype, hyppig i CD36-bindende isolater 12,23-24. Vi har brukt denne analysen å identifisere tre hovedpunkter: 1) en sterk in vitro klumper fenotype av P. falciparum isolert fra Malawiske barn som er forbundet med sykdommens alvorlighetsgrad og diagnose 2) reseptor nye P-selektin mediaties klumper på blodplater sammen med CD36, 3) graden av trombocytopeni til stede hos pasienter med CM som er tilstrekkelig til å begrense ytterligere dannelse av klumper i PRBC vitro 12. Involvering av blodplater i klumpe formasjonen er demonstrert ved å undersøke en våt-slide forberedelser som beskrevet i pkt. 6. Blodplater kan isoleres fra PRP ved sentrifugering ved høye hastigheterfor å minimalisere blodgruppe antigene reaksjoner, men brukte vi hel PRP for å minimere for tidlig plateaktivering fra overdreven håndtering og fra den høyhastighets-sentrifugering. Blodplate-aktivitet kan måles ved blodplateaggregering test med svake blodplate-agonister, adrenalin eller adenosindifosfat (ADP) 25 som beskrevet i 26.
Det er flere aspekter ved assay som tidligere har vært dårlig karakterisert, en av dem er betydningen av å velge PRP kilder og effekten av blod antigen grupper på resultatet av analysen. Vi forberedte PRP fra personer som var blodtype O + og ikke hadde tatt noen medisiner i de siste 7-10 dager før blodet er trukket som noen legemidler kan påvirke blodplater atferd.
Andre faktorer som kan påvirke klumper suksess inkluderer PRBC hematokrit, parasittmengden nivåer og lengde på klumper analysen. Ved hjelp av høy hematokrit og blodplater count det ville være vanskelig å si om klyngen er virkelig en klump eller om for mange celler blir bare sitter sammen fordi de er tettpakket 15. Klumper også generelt øker med lengre inkubasjonstidene. Disse er alle nyttige retningslinjer som bør vurderes ved utforming klumper studier.
Vi finner at prøver fra ulike kliniske grupper kan analyseres parallelt med PRP fra samme donor om det er mulig å gjøre det, men i begrenset ressurs innstillinger som feltet nettsteder transfusjon bassenget er generelt begrenset. Det er derfor vanskelig å ha en enkelt O + donor for å standardisere assayene. Vi har derfor identifisert flere O + givere for å sikre blodtype der det er mulig. Bruke flere givere er også nyttig i tilfeller av store prøver størrelser slik at byrden av blodgivning ikke faller på bare ett individ.
Prøvepunkter på 15-20 min er mye mer gjennomførbart hvis en enkelt person gjennomfører analysene, noe som åpner for våt-skli forberedelser og gjennomføring av analysen kinetikk uten prøvetaking ganger overlappende. De fleste av de mikroskopiske data er visuell og noe objektiv, og derfor er det viktig at Celletellingen verifiseres ved mer enn en person. I så fall kan håndtere en prøve av gangen tillate fullstendig analyse av 03:57 prøvene en dag, avhengig av personlig effektivitet.
Blodplater-mediert klumper kan utføres med både klinisk og laboratorie isolater. For laboratorium linjer, anbefales det at CD36 bindende parasitter brukes til å maksimere klumper frekvenser. Analysen kan være kombinert med andre agglutinasjon som rosetterende assays eller brukes i klumper inhiberings-analyser som vil muliggjøre studier av reseptorer på blodplatene, som kan PRBC medierer binding, en dårlig forstått og undersøkt aspekt av denne fenotype.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble gjort mulig ved støtte fra The Wellcome Trust. JM (080 964) og SCW (080948) ble støttet av Wellcome Trust stipend og DT med et Malawi-Liverpool-Wellcome Trust studentship.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-092 | |
Acridine orange | Invitrogen | A3568 | 10 mg/ml |
Gelofusine | B Braun | Gelofusine | |
1 M HEPES | Invitrogen | 15630 | |
Gentamycin | Invitrogen | 15750045 | 50 mg/ml |
Albumax | GIBCO | 1102-037 | |
Sodium citrate vacutainer | BD | 362760 | 4 ml capacity |
Inverted Microscope | Leica | MD16000 B | |
Fluorescent microscope | Leica | EL6000 | Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide |