यहाँ हम थोक टी सेल आबादी से कृत्रिम प्रतिजन कोशिकाओं (aAPC) का उपयोग मानव NKT कोशिकाओं को सक्रिय करने और विस्तार के लिए एक विधि का वर्णन है. उपयोग के CD1d आधारित aAPC की कार्यात्मक NKT कोशिकाओं की उच्च संख्या पैदा करने के लिए एक मानक तरीका प्रदान करता है.
Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCRα chain rearrangement: Vα14Jα18 in mice and Vα24Jα18 in humans, which is associated with Vβ chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with α-Galactosylceramide (α-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.
aAPC NKT सेल सक्रियण के लिए बुनियादी आवश्यकताओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और यह दत्तक immunotherapy के लिए एन.के. टी कोशिकाओं की पूर्व vivo विस्तार के लिए संभावित नैदानिक मूल्य है. पहली मनका आधारित प्रणालियों के Mescher एट अल., Biotinylated murine जहां MHC वर्ग मैं पेप्टाइड एकल श्रृंखला constructs वर्णित किया गया biotinylated costimulatory B7.1 और streptavidin माध्यम B7.2 अणुओं के साथ लाटेकस microspheres 14, 15 की सतह के लिए संयुक्त. यह दृष्टिकोण सफलतापूर्वक ट्रांसजेनिक चूहों से प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए किया गया है. इसके अलावा, के बाद से इस दृष्टिकोण MHC अणुओं के समरूप लोडिंग सुनिश्चित करने के लिए एक एकल श्रृंखला परिसर MHC पेप्टाइड का उपयोग करता है, तो प्रत्येक लक्ष्य पेप्टाइड प्रतिजन वांछित एकल श्रृंखला MHC-पेप्टाइड परिसर की अभिव्यक्ति के लिए एक नई अभिकर्मक की आवश्यकता होती है, इस प्रकार की व्यापकता को सीमित होगा दृष्टिकोण. महत्वपूर्ण बात है, डॉ. Schneck समूह मनका आधारित aAPC एक और गैर सेलुलर मनका आधारित aAPC के विकास का बीड़ा उठाया, चुंबकीय मोतियों पर एचएलए पुलिस महानिरीक्षक, 1 संकेत, और विरोधी CD28, 2 संकेत युग्मन द्वारा बनाई गई है. एचएलए पुलिस महानिरीक्षक, एचएलए का एक अद्वितीय multimeric फार्म एक immunoglobulin आणविक पाड़ 16, 17 के लिए जुड़े हुए उनके समूह द्वारा विकसित किया गया था. बाद में, वे MHC-आईजी आधारित aAPC का विकास किया है, जो प्रभावी ढंग से सीएमवी और मार्ट एक विशिष्ट 18 सीटीएल का विस्तार करने के लिए दिखाया गया है. यहाँ, हम दिखा दिया है कि CD1d पुलिस महानिरीक्षक आधारित aAPC कार्यात्मक NKT कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अध्ययन में एक इसी तरह की प्रणाली का इस्तेमाल किया गया है एन.के. कोशिकाओं की 19 CD1d साथ शारीरिक संपर्क की जांच की.
विशेष रूप से, हम एक कृत्रिम प्रतिजन सेल है जो किसी भी आवश्यकताओं के हम इष्टतम NKT सेल प्रसार के लिए आवश्यक हैं के लिए अनुकूल है डिजाइन किए हैं. aAPC विस्तार विधि विस्तार और समृद्ध मानव NKT कोशिकाओं के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. हमारे aAPC व्यवस्थित संभावित costimulatory अणुओं के एक पैनल की भूमिका का मूल्यांकन और NKT सेल प्रसार पर उनकी भूमिका का आकलन करने के लिए संशोधित किया जा सकता हैtion और समारोह. इस प्रकार, aAPC एक मजबूत बहुमुखी NKT कोशिकाओं उत्प्रेरण और विस्तार के लिए उपयोगी प्रौद्योगिकी का प्रतिनिधित्व करते हैं. aAPCs की पीढ़ी के कम से कम एक सप्ताह लेता है और मोतियों की बड़ी मात्रा के उत्पादन के लिए उपयुक्त है. हालांकि, aAPC पैदा करने में पुष्टि की है कि पुलिस महानिरीक्षक CD1d stably मोतियों की सतह पर स्थिर है और उनकी कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए बैच के बैच के लिए स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. प्रणाली का एक संभावित सीमा है कि वहाँ जगह में एक तंत्र के लिए रवाना उत्तेजना बारी, मोतियों की यांत्रिक हटाने के अलावा अन्य नहीं है. विशेष रूप से, प्रतिजन के साथ टी सेल रिसेप्टर (TCR) की सगाई: CD1d/MHC जटिल आम तौर पर सहायक / आसंजन अणुओं के साथ मिलकर प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse, है जो दोनों टी सेल और पर निरोधात्मक या दमनकारी कारकों की प्रेरण में परिणाम कर सकते हैं उत्पन्न प्रतिजन सेल पेश. AAPC प्रणाली में, इन कारकों टी सेल द्वारा upregulated किया जा सकता है, लेकिन मनका आत्मीय ligands नहीं व्यक्त करेंगेइन रिसेप्टर्स के लिए.
इसके अलावा, CD4 + NKT कोशिकाओं को चूहों और इंसानों में अर्बुदरोधी प्रतिक्रियाओं को दबाने के लिए दिखाया गया है, इसलिए यह संभव है कि सभी NKT कोशिकाओं (यानी α-GalCer के साथ वैश्विक उत्तेजना) या गलत सबसेट की सक्रियता के nonselective सक्रियण अवांछित प्रतिरक्षाविज्ञानी में परिणाम सकता है परिणाम. नतीजतन, एक phenotypically और कार्यात्मक aAPC विस्तार NKT सेल की आबादी को चिह्नित करना चाहिए. के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है, हमने पाया है कि α-GalCer भरी हुई aAPC के साथ उत्तेजना विरोधी CD28 व्यक्त NKT कोशिकाओं TH1 उत्पादन, Th2, और Th17 प्रकार साइटोकिन्स परिणाम कर सकते हैं. Murine अध्ययनों की रिपोर्ट है कि IL-33, एक हाल ही में पहचाना cytokine, के साथ चुनौती IL-5 और IL-13 के रूप में भड़काऊ साइटोकिन्स परिसंचारी के स्तर में वृद्धि के परिणामस्वरूप. NKT कोशिकाओं के आईएल-33 के साथ इलाज उनके cytokine 20 उत्पादन बढ़ाया. 33 आईएल ST2 के लिए एक विशिष्ट ligand है और यह दिखाया गया है कि घुलनशील ST2 can ब्लॉक IL-33 संकेतन. इस प्रकार, एक भविष्य आवेदन के एक उदाहरण के रूप में, aAPC व्यक्त ST2 और उत्पन्न किया जा सकता है यदि एक निर्धारित करने चुनिंदा Th2 साइटोकिन्स का उत्पादन रोकना जबकि NKT कोशिकाओं द्वारा TH1 cytokine स्राव उत्प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया. यह भी कहा गया है कि चतुर्थ के इंजेक्शन Kb व्यक्त में aAPC C57BL / 6 चूहों कम 21 ट्यूमर के फेफड़ों मेटास्टेसिस में हुई. महत्वपूर्ण बात है, इन आंकड़ों है कि फेफड़ों के लिए यातायात aAPC प्रदर्शन और effector टी सेल सबसेट को सक्रिय करने में सक्षम हैं. इसलिए, एक aAPC के कई प्रकार उत्पन्न करने के लिए और विशिष्ट प्रतिजन टी सेल सबसेट के बीच परस्पर क्रिया की जांच सकता है. संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, इन अध्ययनों दिखाना है कि CD1d आईजी आधारित aAPC सामान्य सेलुलर APC की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है, और NKT सेल immunotherapy आधारित दत्तक के लिए वर्तमान नैदानिक दृष्टिकोण को बढ़ाने की क्षमता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के लिए उपयोगी विचार – विमर्श के लिए प्रियंका सुब्रह्मण्यम का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. लेखकों को कोई वित्तीय हित प्रतिस्पर्धा है. इस काम अमेरिकन कैंसर सोसायटी, NIH / NCI CA131487 K01, CA162273 R21, R21, CA162277 और P30 ट्यूमर इम्यूनोलॉजी और Immunotherapy TJ वेब के लिए कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Ficoll-Paque PLUS | GE Life Sciences | 17-1440 | |
EasySep Human T Cell Enrichment Kit | StemCell Technologies | 19051 | |
Allophycocyanin CD161 human mAb | Pharmingen | 550968 | |
EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18002 | |
Anti-mouse IgG1 Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-047-101 | |
Dimer XI Recombinant Soluble Dimeric Mouse CD1d:IG Fusion Protein | BD Biosciences | 557599 | |
Anti-CD28 mAb | Biolegend | 302914 | |
M-450 Epoxy beads | Life Technologies | 150-11 | |
Alpha-galactosylceramide (KRN7000) | Axxora, LLC | BML-SL232-0100 | |
RPMI 1640 Medium | Sigma Aldrich | R 0883 | |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
Vitamin Solution | Gibco | 11120-052 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | ||
Ciprofloxacin | Alexis Biochemicals | 380-288-G025 | |
PE-Vα24Jα18 | Biolegend | 342904 | |
PE-Vα24 (Clone C15) | Beckman Coulter | A66907 | |
FITC-Vβ11 (Clone C21) | Beckman Coulter | A66905 | |
PE-CD1d | Biolegend | 123510 | |
PE anti mouse IgG1 | BD Biosciences | 556650 | |
FITC anti-mouse IgG2a | Biolegend | 407105 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190250 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | S8032 | |
Bovine Serum Albumin | American Bioanalytical | AB00440-00100 | |
EDTA | Sigma Aldrich | 431788 | |
IL-2 (Proleukin) | BD Biosciences | 354043 | |
Human AB Serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
Labquake Tube Rotator | Fisher Scientific | 13-687-10Q | |
BD Falcon 5 ml polystyrene round-bottom tubes | Fisher Scientific | 14-959-1A | |
Wheaton Glass Sample Vials with Cap | Fisher Scientific | Small (03-343-6A ) Large (03-343-6E) |