דור מהיר ויעיל של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם בפורמט פלייט Multititre
Summary
פרוטוקולים להתמיינות עצבית של תאי גזע האנושי pluripotent (hPSCs) הם לעתים קרובות זמן רבים ודורשים מיומנויות סלולריות תרבות משמעותיות. הנה, יש לנו מותאם הליך בידול מולקולה מבוססת קטן לפורמט צלחת multititre, המאפשר לדור פשוט, מהיר ויעיל של תאי עצב אנושי באופן מבוקר.
Abstract
פרוטוקולים קיימים לדור של נוירונים מתאי גזע pluripotent אדם (hPSCs) הם לעתים קרובות מייגעים שבהם נהלים רבים שלבים המעורבים הבידוד וההתרחבות של תאים מבשרים עצביים, לפני ההתמיינות סופנית. בהשוואה לגישות זמן רב אלה, שמצאנו לאחרונה כי עיכוב משותף של שלושה מסלולי איתות, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 וFGF / ERK, מקדם אינדוקציה מהירה של neuroectoderm מhPSCs, ואחריו בידול מיידי לנוירונים פונקציונלי. הנה, יש לנו הנוהל שלנו הותאמו לפורמט צלחת multititre רומן, כדי לשפר עוד יותר את השחזור שלה וכדי לעשות את זה תואם עם יישומי אמצע תפוקה. היא כוללת ארבעה ימים של היווצרות neuroectoderm בתחומים צפים (גופי embryoid), ואחריו ארבעה ימים נוספים של בידול לנוירונים בתנאי חסיד. רוב התאים שהושגו עם פרוטוקול זה להיראות נוירונים חושיים דו קוטביים. יתר על כן,ההליך הוא יעיל ביותר, אינו דורש מיומנויות מומחה מסוימות, והוא מבוסס על מדיום הגדרה כימית פשוט עם מולקולות קטנות חסכוניות. בשל תכונות אלה, ההליך עשוי לשמש כפלטפורמה שימושית לחקירה פונקציונלית נוספת וגם להקרנה מבוססת תאים מתקרב דורש נוירונים חושיים אדם או נוירונים מכל סוג.
Introduction
hPSCs, המהווים עוברי מופקים תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (hiPSCs), הוא משמעות pluripotent שהם יכולים להצמיח שושלות תאים שונות במבחנת 1-2. סוגי תאים מובחנים רבים שנגזרים מhESCs עד כה, תומכים ברעיון כי התאים הללו מהווים כלים חשובים למחקר מדעי וגישות הקרנה מבוססות תאים, והבטחה עבור תרופות מבוססות תאים.
פרוטוקולי בידול עצביים לhESCs הם בדרך כלל מורכבים ודורשים זמן רבים כפי שהם לעתים קרובות מבוססים על גורל 1 התרמה כולל עצבי, ואחרי בידוד ידני של אבות עצביים, ובידול מסוף רציף שסוג נוירון עניין מסוים 3-6. בהקשר מסוים, מורכבות זו אינה מפתיעה ובלתי נמנעת בהתחשב בכך שפרוטוקולי בידול מכוון כגון מדינה-of-the-art נוטים לחקות שלבי התפתחות אנושית מוקדמת, whicח הוא בעצמו מורכב ביותר. מצד השני, היא עשויה בחלקו גם משקפת חוסר ההבנה שלנו את התהליכים המולקולריים שבבסיס, וכתוצאה מפרוטוקולי בידול, כי הם עדיין רחוקים מלהיות מותאמים באופן מלא.
בכל קשור להמרה של hPSCs עבר התמיינות לneuroectoderm, פרה et al. מצא כי דיכוי איתות BMP / SMAD1/5/8 משפר השראה עצבית של 7 hESCs. יתר על כן, איון של SMAD2 / 3 איתות הוכח לקדם היווצרות neuroectoderm 8. בהתאם לכך, בשילוב של איון שני מסלולים אלה נוטה להוביל להשראה עצבית יעילה יותר של hPSCs 4,9. לאחרונה, שהראינו כי מסלול איתות שלישית, FGF / ERK, משמש כמדכא חזקה של את הצעדים הראשונים של מחויבות neuroectodermal בhESCs. מנגד, דיכוי סימולטני של כל שלושה מסלולים אלו מובילים להמרה כמעט הומוגנית של hESCs לneuroectoderm עםבארבעה ימים בלבד 10. לאחר מכן, בידול מסוף היעיל ביותר לנוירונים פונקציונלי נצפה בתוך שמונה ימים. הנוירונים שהושגו היו עשויים להיות נוירונים חושיים של מערכת עצבים ההיקפית, שעשוי בחלקו להסביר הגזירה המהירה שלהם 10. ליקויים בתחזוקת נוירון חושית נחשבים סיבה להפרעות אדם מסוימות, כגון 11 דיסאוטונומיה משפחתית. לדוגמנות מחלות כאלה המבוססים על טכנולוגית hiPSC 12, לאפיון פונקציונלי נוסף, כמו גם למטרות שימושיות שלא דורשים כל סוג מסוים של תאי עצב, הליך הבחנה זו עשויה להציג בסיס שימושי.
עם זאת, אסטרטגית הבידול העסקנו היווצרות מעורבת של גופים עובריים (EBS) במקור מגושים של מושבות hESC 10, וזה הביאה די מידת ההטרוגניות לגבי גדלי EB, והופיעה גם להתפשר יעילות היווצרות תא עצב בחלק ceקווי LL. יתר על כן, בשל ההטרוגניות בגדלי EB, היכולת השיטתית כדי לבחון השפעות של גורמי גדילה נוספים או מולקולות קטנות במהלך ואחרי היווצרות נוירון נראה היה מבולבלת במקצת.
בדו"ח זה, התאמן ההליך הקודם שלנו לטכניקה בינונית תפוקה תואמת, נאלצה צבירה מבוססת לייצר EBS באופן מאוד גודל מבוקר, כפי שהראה גם בהקשרים אחרים 13. כתוצאה מכך, נוצר EBS בבארות בצורת V של צלחות גם 96-הועברו לקובץ מצורף בצורת U נמוך במיוחד 96-גם צלחות, ליזום היווצרות neuroectoderm בהשעיה. ארבעה ימים לאחר מכן, EBS יכול להיות מצופה מהוליד הנוירונים נבדלים סופנים ביעילות גבוהה והומוגניות. לחלופין, יום-4 EBS היו ניתק לתוך תאים בודדים ומצופה כאמורים, אשר הביא monolayers צפיפות הנמוכה של תאי עצב אנושיים. תוצאות עקביות וכך התקבלו הרבה באופן עצמאי 2 דהקווים מבוקעים hESC, HuES6 וNCL3.
כתנאי מוקדם, היווצרות EB המוצלחת הייתה בהחלט תלויה בשימוש בפולימר סינטטי, אלכוהול פוליוויניל (PVA), יחד עם מעכב ROCK Y-27632 הידועים כדי לקדם הישרדות hESC 13-14. כתוצאה מכך, ההומוגניות של EBS נוצרה ב96-V-צלחות היה משופר באופן משמעותי בהשוואה להיווצרות של EBS כתרבויות המוניות המבוססות על טכניקות פיצול אקראיות. מערכת זו ובכך מספקת פלטפורמה השתפרה באופן משמעותי להיווצרות neuroectoderm בתרבות השעיה, ואחרי היווצרות נוירון מבוקרת מאוד בתנאי חסיד.
Protocol
Representative Results
Discussion
רוב פרוטוקולי בידול מעורבי היווצרות EB מhPSCs, כולל ההליך שלנו שפורסם בעבר 10, מבוססים על קצירה ידנית או בסיוע של האנזים hESCs כאגרגטים, שמוביל בהכרח להטרוגניות בגדלי EB. עובדה זו מובילה לשונות ביעילות בידול עם כמה שורות תאים, ובכך הופך את הניתוח שיטתי קשה, במיוחד בקנה מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי אגודת מקס פלנק.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Matrigel HC | Becton Dickinson | 354263 | See text for details on handling |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 21331-020 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma | 363170 | Dissolve at 0.4% in DMEM/F-12 using an ultrasonic waterbath / avoid overheating / can be kept at 4 °C for several weeks |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 100X, store as frozen aliquots |
| B27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | 50X, store as frozen aliquots |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A1595 | 10% = 500X, store as frozen aliquots |
| L-Glutamine with Penicillin / Streptomycin | PAA | P11-013 | Or equivalent |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | Dissolve at 10 μg/ml in 0.1% BSA / PBS = 1000X, store as frozen aliquots |
| ROCK inhibitor Y-27632 | abcamBiochemicals | Asc-129 | Dissolve at 10 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| PBS | PAA | H15-002 | Or equivalent |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| 96-well V-bottom plates | Nunc | 277143 | |
| PD0325901 | Axon Medchem | Axon 1408 | Dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| SB431542 | abcamBiochemicals | Asc-163 | dissolve at 15 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| Dorsomorphin | Santa Cruz | sc-200689 | dissolve at 0.5 mM in DMSO = 1000X, store as frozen aliquots |
| 96-well U-bottom ultra-low attachment plates | Corning | 7007 | |
| beta-III Tubulin antibody (mouse) | Sigma | T8660 | use at 1:1000 |
| beta-III Tubulin antibody (rabbit) | Covance | PRB-435P | use at 1:2000 |
| BRN3A (POU4F1) antibody | Santa Cruz | sc-8429 | use at 1:500 |
| Table 1. Specific reagents and equipment. |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Pera, M. F., et al. Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin. J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity. Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).
- Greber, B., et al. FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874-4884 (2011).
- Anderson, S. L., et al. Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene. Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25, 929-938 (2007).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6, e18293 (2011).
