Bronchoalveolaire Lavage (BAL) voor onderzoek; verkrijgen adequaat monster Yield

Summary

We beschrijven een onderzoek techniek voor fiberoptische bronchoscopie en bronchoalveolaire lavage met behulp van lage druk zuigkracht. De techniek wordt gebruikt om immuuncellen oogsten uit de longen bronchoalveolaire oppervlakken. Plaatselijke verdoving en milde sedatie (midazolam) gebruikt. Onderwerpen tolereren de procedure goed en ervaring minimale bijwerkingen.

Abstract

We beschrijven een onderzoek techniek voor fiberoptische bronchoscopie met bronchoalveolaire lavage (BAL) met handmatige hand gehouden zuigkracht om niet-hechtende cellen en longvoering vocht uit het mucosale oppervlak te verwijderen. In het onderzoek omgevingen, BAL maakt bemonstering van aangeboren (long macrofagen), cellulair (B-en T-cellen), en humorale (immunoglobuline) reacties in de longen.

BAL is internationaal geaccepteerd voor onderzoeksdoeleinden en sinds 1999 de techniek is uitgevoerd in> 1000 personen in het Verenigd Koninkrijk en Malawi door onze groep.

De techniek maakt gebruik van zachte hand-held aanzuigen van fluïdum ingeprent, dit is ontworpen om maximale BAL volume geretourneerd en toepassen minimale afschuifkracht op trilharen epitheel om de structuur en functie van cellen in de BAL-vloeistof behouden en levensvatbaarheid behouden om de groei te bevorderen van cellen in ex vivo cultuur. Het onderzoek techniek maakt gebruik dus een groter volume insdestillaat (meestal in de orde van 200 ml) en maakt gebruik van handmatige zuigkracht naar cel schade.

Patiënten krijgen plaatselijke verdoving aangeboden bewuste sedatie (midazolam), en tolereren de procedure goed met minimale bijwerkingen. Mondelinge en schriftelijke vakinformatie verbetert tolerantie en informed consent is verplicht. Veiligheid van de betrokkenen is essentieel. Onderwerpen worden zorgvuldig geselecteerd met behulp van duidelijke criteria in-en uitsluiting.

Dit protocol bevat een beschrijving van de mogelijke risico's en de maatregelen die zijn genomen om ze te verzachten, een lijst van contra-indicaties, pre-en post-procedure controles, alsmede nauwkeurige bronchoscopie en laboratoriumtechnieken.

Introduction

Achtergrond

Glasvezel bronchoscopie is ontwikkeld voor de klinische praktijk, en wordt veel gebruikt zowel diagnostisch en therapeutisch ^1,2. Bronchoalveolaire lavage (BAL) verwijdert niet-hechtende cellen en longvoering vocht uit het mucosale oppervlak; biopsie wordt gebruikt om mucosale en submucosale weefsels proeven. In onderzoeksomgevingen BAL laat bemonstering van aangeboren (longmacrofagen ^3-5), cellulaire (B-en T-cellen ⁶⁾ en humorale (immuunglobuline ⁷⁾ reacties in de longen.

BAL is internationaal geaccepteerd voor onderzoeksdoeleinden ⁸ en sinds 1999 de techniek is uitgevoerd in> 1000 personen in het Verenigd Koninkrijk en Malawi door onze groep. We gebruiken deze techniek in studies van aangeboren, cellulaire en humorale immuunrespons tegen pneumokokken antigeen inbegrip van experimentele menselijke pneumokokken vervoer ^9,17, biomassa-rook ^5, HIV en vaccinatie, en aanvullende behandeling stusterft naar herstel van een longontsteking. De techniek maakt gebruik van zachte hand-held aanzuigen van fluïdum ingeprent, dit is ontworpen om BAL volume terug te maximaliseren en toepassen minimale afschuifkracht op trilharen epitheel om de structuur en functie van cellen in de BAL-vloeistof behouden.

In onderzoeksverband gebruikt BAL een andere techniek dan die beoefend door ademhalings-en intensive care artsen (vaak genoemd bronchiale wassen, wassen, maagspoeling, of BAL) die zijn gericht op diagnostische of therapeutische voordeel te krijgen. Het onderzoek techniek is ontworpen om cellen te oogsten en levensvatbaarheid behouden om de groei van cellen in ex vivo kweken bevorderen. Om deze redenen is het onderzoek techniek maakt gebruik van een groter volume instillate (typisch in de orde van 200 ml) en maakt gebruik van handmatige zuigkracht naar cel schade. Patiënten krijgen plaatselijke verdoving aangeboden bewuste sedatie (midazolam), en tolereren de procedure goed met minimale bijwerkingen. Mondelinge en schriftelijke subjectievet informatie verbetert de tolerantie en schriftelijk toestemming is ^{verplicht: 1.}

Doel

Het algemene doel is dat de procedure veilig en effectief moet zijn. Onderwerpen mogen ervaren geen fysiologische verstoring en exploitanten moeten consequent verzamelen van meer dan 100 ml BAL van onderwerpen. Na de procedure, moeten onderwerpen minimale bijwerkingen ervaren.

Veiligheid

Veiligheid van de betrokkenen is essentieel. Onderwerpen worden zorgvuldig geselecteerd met behulp van duidelijke criteria in-en uitsluiting. Dit protocol bevat een beschrijving van de mogelijke risico's en de genomen maatregelen om de emissies te verminderen.

Contra-indicaties voor onderzoek bronchoscopie kan worden uitgedrukt in absolute of relatieve, en zijn opgenomen in onze studie protocol als uitsluitingscriteria en integratie. Onze onderwerpen zijn allemaal gescreend om volledige gezondheid te waarborgen.

Absolute contraonder instabiele cervicale wervelkolom, reageert hypoxie, instabiele angina, bloedingsdiathese, en kwaadaardige hartritmestoornissen.

Relatieve contra, waaronder die aandoeningen geassocieerd met verhoogde complicaties omvatten:

Algemeen: slecht coöperatie onder ^1, geen significante algemene medisch probleem bijv. epilepsie, vorige slecht verdragen bronchoscopie, bekende bijwerkingen van lidocaïne of midazolam, zwangerschap, slechte voeding.

Respiratoire: hypoxie [saturaties (satellieten) op lucht <94%], hypercapnie, instabiele astma ^1, aanzienlijk verminderde respiratoire functie ¹ (FEV ₁ <1 L), pulmonale hypertensie.

Cardiovasculair: uremie, binnen 6 weken na myocardinfarct ^1, superior vena cava obstructie.

Andere: immunosuppressie (onze groep regelmatig deze procedure uitvoertdure bij HIV positieve personen).

Zie tabel 1 – Risico's verbonden aan BAL voor onderzoek.

Protocol

1. De onderwerpen worden voldaan bij aankomst door de Respiratory Research Nurse Het onderwerp is het vasten gedurende> 4 uur voor vast voedsel en 2 uur voor heldere vloeistoffen 1. De procedure wordt uitgevoerd als een dagopname met passende pre-en post-procedure controles (volgens de standaard ziekenhuis-beleid). Het onderwerp draagt ​​een ziekenhuis jurk. Een kleine gauge canule wordt ingebracht (idealiter in de linker) en in situ blijft tot het einde van de post-procedure herstelperiode 1. Preprocedure waarnemingen worden genomen (bloeddruk, hartslag, zuurstofverzadigingen [SATS]). Het onderwerp wordt overgebracht naar de bronchoscopie suite. 2. Het onderwerp is voorbereid op de procedure in de Suite van een Respiratory Research clinicus Ervaren in bronchoscopie Controle van apparatuur is aangesloten, zoals 3-lead ECG, saturatiemeter 1,10 en bloeddrukmeter. Anesthetic ondersteuning is niet nodig met inbegrip van informed consent. Zuurstof kan via zuurstofbril worden afgeleverd bij maximaal 4 L / min, om satellieten te bereiken> 90% 1. De operator controleert de bronchoscoop, dit omvat het garanderen van een effectieve zuigkracht door opzuigen steriele fysiologische zoutoplossing. Topische anesthesie met lidocaïne kan op de neus (met Instillagel 1) en het mondslijmvlies (met Xylocaine) Als sedatie passend en door de proefpersoon gevraagd, wordt intraveneus midazolam toegediend 1. Een passende omkering agent (flumazenil) is per direct beschikbaar. Reanimatie apparatuur moet gemakkelijk beschikbaar 1,10 zijn. 3. De bronchoscoop is geplaatst en gepositioneerd Intubatie is meestal via de neus. Indien dit niet mogelijk vanwege neuspoliepen, ontstoken neusschelpen of ongemak dan het onderwerp geïntubeerd via de mond (een mond-wacht wordt gebruikt ter voorkomingbeschadiging van de reikwijdte of de tanden van de patiënt). Topische verdoving bij de larynx wordt voltooid met 4% lidocaïne, gewoonlijk in totaal 4-6 ml gebruikt. Gewoonlijk dit veroorzaakt hoesten op instillatie. De stembanden worden doorgegeven, en verder mucosale anesthesie met behulp van 2 ml van 2% lidocaïne bij de kiel, bij de verdeling van de rechter onderste kwab (RLL) en rechts midden kwab (RML) en bij de RML ingang. De bronchoscoop is gepositioneerd binnen de RML, idealiter in het mediale segment in een positie waar het distaal genoeg om in een veilige positie, maar niet te distale zodat de luchtwegen instort wanneer zuigkracht wordt toegepast ('Wink test' met de zuigknop ). Goede positionering wordt tijdens de knipoog proef aangegeven door een bronchoscoop die volledig kan worden gehandhaafd in positie door de bronchoscopist en een luchtweg dat niet volledig te sluiten direct op zachte zuigkracht. 4. De BAL wordt uitgevoerd Vier 60 ml spuiten zijn pregevuld met verwarmde zoutoplossing – 60 ml, 50 ml, 50 ml en 40 ml in opeenvolgende spuiten. Wanneer het onderwerp en bronchoscopist zijn klaar de eerste spuit van zout is ingeprent door de bronchoscopie assistent terwijl de bronchoscopist handhaaft de positie in de RML. Zachte hand zuigkracht wordt vervolgens uitgevoerd door de assistent met dezelfde poort en 50 ml spuit. Deze procedure wordt dan herhaald nog 3x, met een maximaal volume van 200 ml in onze specifieke techniek. De opgehaalde BAL vloeistof wordt voorzichtig verdreven in gelabelde containers al op smeltend ijs gehouden. Glascontainers kunnen worden presiliconized om celhechting te remmen en het maximaliseren cel terugkeer. De BAL vloeistof verschijnt wazig tegen het licht met oppervlakte zeepbellen gevormd door oppervlakteactieve stoffen. De bronchoscoop wordt langzaam volledig teruggetrokken. De BAL vloeistof wordt vervoerd onverwijld op ijs voor onmiddellijke verwerking. 5. Onderwerp Recovery </p> Het onderwerp wordt teruggewonnen voor 2-4 uur door het respiratoir onderzoek verpleegkundige op een afdeling. Gedurende deze tijd ze mogen rusten en dan alleen eten en drinken> 60 min 1 na de procedure (wanneer hun zwaluw wordt beoordeeld als veilig), om het risico van aspiratie. Postprocedure waarnemingen worden gecontroleerd en geregistreerd. Een klinisch onderzoek plaatsvindt vóór lozing. Het onderwerp wordt geïnformeerd predischarge over de vaak voorkomende bijwerkingen (koorts, milde recht submammary pijn op de borst, keelpijn) en krijgt een telefoonnummer voor het geval significante bijwerkingen optreden 1. Het onderwerp wordt opgevolgd op 1-5 dagen na de procedure met een klinische contact. Dit kan ofwel via telefoon of persoonlijk. 6. De cellen worden in het laboratorium geïsoleerd – Speel op Smeltend Ijs waar mogelijk Het volume van BAS vloeistof wordt opgenomen en gefiltreerd door een dubbele laag steriel gaas wattenstaafjeom slijm pluggen verwijderen in prechilled, steriele 50 ml centrifuge buizen. Cellen worden gepelleteerd door centrifugatie bij 500 xg bij 4 ° C gedurende 5-10 minuten en gewassen door vortexen in 50 ml koude normale zoutoplossing. Centrifugeren wordt eenmaal herhaald. Cellen worden opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium (RPMI-1640 + 10% foetaal runderserum + 2 mM L-glutamine + penicilline [40 IE / ml], streptomycine [75 IE / ml], en amfotericine B [0,5 IU / ml]) en differentiële telling uitgevoerd met een gelijk volume van trypan blauw en een hemocytometer. De celsuspensie wordt genormaliseerd om de gewenste dichtheid (we 1 x 10 6 cellen / ml), geïntroduceerd door pipetteren in geschikte weefselkweek platen en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 3 uur tot macrofagen hechting mogelijk. 1 ml van deze celsuspensie per putje is geschikt voor 24 putjes. Voor lymfocyten werken, na 3 uur incubatie, het kweekmedium wordt voorzichtig op en neer gepipetteerd 3x, en verzameld. Dit medium bevat lymfocytenen hechtend macrofagen en kunnen worden gebruikt om lymfocyt functie getest, maar kan ook worden gebruikt in zuiveringsstappen bijv. met CD14 magnetische parels macrofagen verwijderen. Voor macrofagen werken, na 3 uur incubatie, het medium wordt zorgvuldig verwijderd met minimale pipetteren en vervangen door verse, warme medium zonder antibiotica (RPMI 1640 + 10% foetaal runderserum + 2 mM L-glutamine). De macrofagen aanhanger van de weefselkweekplaat (zie figuur 1).

Representative Results

Goede klinische resultaten zijn een BAL volume van meer dan 100 ml en een patiënt die heeft ervaren hooguit kleine ongemakken (zie tabel 1). Dit vereist een ontspannen en coöperatieve onderwerp. De arts moet er zeker van zijn, volledig voorbereid (materialen), en begrip voor de vrijwilliger. Inter-en intra-individuele variabiliteit in cellulaire opbrengst (inclusief differentiële tellingen) is beschreven. Differentiële celtellingen van gezonde proefpersonen typisch> 90% macrofagen met kleine aantallen neutrofielen (<2%) en lymfocyten (5-10%). BAL cellen gecentrifugeerd op objectglaasjes kunnen worden gekleurd met een differentiële nucleaire vlek deze informatie (figuur 1) te verkrijgen. In figuur 1, zijn BAL cellen werden gefixeerd en gekleurd met Hemacolor kleuring volgens de instructies van de fabrikant. Tenminste 300 cellen worden geteld om betrouwbare resultaten te verkrijgen macrofagen,neutrofielen en lymfocyten, 500 cellen voor zeldzame celtypen. Risico Risico Verminderde in dit protocol door: Effect van bronchoscopie en BAL 1, 14 Licht ongemak <25% 14 # Passende pijnstilling en sedatie. Zelfverzekerd en zorgzame benadering van het onderwerp. Epistaxis <1% # Milde druk alleen nasale intubatie. Als onderwerp ongemak of vernauwde opening – orale intubatie plaats. Endobronchiale bloeding (bloedspuwing) <0.1% * 15 Geen biopten genomen. Zorgvuldige controle tijdens bronchoscopie – het vermijden van de luchtwegen slijmvlies. Nausea, braken en aspiratie pneumonie <0,02% 14 # Vasten voor vast voedsel> 4 uur preprocedure 1. Adequate topische anesthesie. Semirecumbent positie tijdens de procedure. Voorzichtig na de procedure observatie. Koorts 0.01 14-1% #, 16 Betrekking tot ontsteking, en kunnen geminimaliseerd door maximale inzameling van BAL. Slechts enkele kwab BAL. # Zere neus / keel en heesheid <25% 14 # Voldoende actueel verdoving van de neus, keel en strottenhoofd (minimaliseren hoesten). Infectie <0,1% in HIV-negatieve, 1% bij HIV positieve 14 # Standaard bronchoscoop wasprocedure 1. Slechts enkele kwab BAL. # Vroegtijdige herkenning van besmetting: klinisch onderzoek binnen 1 uur eend klinische contact 1-5 dagen na bronchoscopie. Pijn op de borst / hoest <0,2% 14 # Single kwab alleen BAL. Maximale BAL collectie. # Effecten van drugs: lidocaïne, midazolam Aritmie Zeer zelden * Maximaal 5 mg / kg 14 lidocaïne gebruikt. Opgewarmd normale zoutoplossing bijgebracht. # Pulsoxymetrie (satellieten> 90% met zuurstof suppletie), hartbewaking hele procedure. Benzodiazepine antagonist (flumazenil) direct beschikbaar. Desoriëntatie / agitatie <0.1% † # Cardio respiratoire depressie Zeer zelden * * Niet ervaren in onze groep in meer dan 1500 onderzoek procedures. † Idiosyncratic plaats dosisafhankelijke reactie. # Ervaring Onze groep is in meer dan 1500 onderzoek procedures. Tabel 1. Risico's verbonden aan BAL voor onderzoek. Dit omvat het gevaar of risico en hoe dit wordt verminderd door het gebruik van de beschreven techniek. Effecten van de bronchoscopie / BAL en ook de effecten van een eventuele medicijnen worden meegenomen. Figuur 1. Een Microscoop Slide Toont BAL Macrofagen en Occasionele neutrofielen. BAL cellen zijn opgelost in methanol en gekleurd met Hemacolor rood (eosine Y) en blauwe (azuurblauwe B).

Discussion

Om goede resultaten te bereiken zijn de volgende nuttig:

1. Goede anesthetisation aan de basis van de tong en posterieure orofarynx. Dit is belangrijk omdat het verbetert procedurele tolerantie van het subject en de comfort.
2. Ofwel een pediatrische (buitendiameter 3,4-3,6 mm) of volwassene bronchoscoop (buitendiameter 4,8-5,9 mm) worden gebruikt.
3. Als er enige ongemak tijdens nasale intubatie, is orale intubatie de voorkeur. In het algemeen nasale intubatie is ofwel een eenvoudige techniek of dienen te worden afgeschaft.
4. Na initiële indruppelen van lidocaïne voor de orofarynx, kunnen de onderhavige bronchoscope worden ingetrokken voorkeur afwachting het begin van de anesthesie, vooral als de bronchoscoop oraal wordt ingebracht.
5. Zorgen voor ten minste 10 x 10 ml spuiten zijn voorgevuld met slechts 2-4 ml lidocaïne. Lucht moet worden overgelaten in de spuiten voor een verbeterde levering van de narcose direct op snoeren en endobronchiale mucosa.
6. Aangezien hoesten tijdens de procedure aanzienlijk vermindert BAL opbrengst; gebruik opgewarmd zoutoplossing en het hebben van goede mucosale verdoving zijn belangrijk om dit te verminderen.
7. De 50 ml spuiten moet worden ingevuld met verwarmd zoutoplossing. Het is gebruikelijk dat de eerste 50 ml normale zoutoplossing ingedruppeld tussen 10-20 ml door dode ruimte verlies en de rest loopt in de terminale luchtwegen oplevert. Aliquots weer een grotere hoeveelheid vloeistof.
8. De bestuurder moet altijd controleren de bronchoscoop voorafgaand aan intubatie, inclusief het verzekeren van effectieve zuigkracht door opzuigen steriele fysiologische zoutoplossing. Verlies van zuigkracht kan vaak optreden als gevolg van knikken van de buis of lekken rond de verbindingen met de bronchoscoop of zuiginrichting.
9. Tijdens het handmatig zuigkracht, idealiter de luchtwegen dienen niet instorten. Als afzuiging herhaaldelijk instort de luchtwegen, worden BAL terug gereduceerd tot een klepmechanisme en lokale ontsteking en bloeden is meer waarschijnlijk: dit op zijn beurt maakt de luchtwegen merts prikkelbaar en hoesten waarschijnlijker. Het kiezen van de meest geschikte RML subsegmentele tak en het gebruik van lage zuigdrukken zijn dus beide belangrijk.
10. Wanneer lucht voortdurend afgezogen controleer de aansluiting van de spuit aan de bronchoscoop en ook de positie van de bronchoscoop in de distale luchtwegen. Als dit een terugkerend probleem, na de procedure ervoor zorgen dat er geen gaten in de bronchoscoop zelf.
11. BAL van rokers vaak donkerder door de aanwezigheid van intracellulaire deeltjes. Rokers kunnen de bronchoscopie tolereren minder goed, en hebben meer hoesten.
12. De voorkeur BAL volume opbrengst is> 100 ml. Een opbrengst van> 150 ml uitstekend. We hebben nog geen opbrengsten> 170 ml ervaren. Er is geen lineair verband tussen de cel opbrengst BAL volume opbrengst.
13. Opbrengsten van <100 ml zijn, in onze ervaring, eerder leiden tot bijwerkingen zoals hoesten, pijn op de borst en koorts. Wij adviseren dat proefpersonen met opbrengsten van <100 reco ml wordenspreekt zich in de linker zijligging, kan deze afvoer van eventueel resterende longvocht helpen.
14. Klinische contact moet met het onderwerp te geschieden binnen 1-5 dagen om geen bijwerkingen te garanderen.
15. Midazolam sedatie wordt gebruikt voor <50% van de patiënten in het Verenigd Koninkrijk en <5% in Malawi. Midazolam lijkt geen directe verbetering van de verdraagbaarheid, bepaalde operatoren vinden dat sedatie soms contraproductief kan het behoud van een samenhangend (en geruststellend) dialoog met het onderwerp.
16. In onze ervaring is er een aanzienlijke leercurve met deze techniek. Bijvoorbeeld coördinatie tussen arts en verpleegkundige kost tijd en levert vaak lager aan het begin van het leerproces.
17. Bij HIV-positieve personen, maken we gebruik van antibiotica profylactisch prebronchoscopy.

Materials

Material	Company	Catalogue Number	Comments
Fibreoptic bronchoscope, light and suction source	unspecified
Surgical gown, sterile gloves	unspecified
Sphygnomanometer	unspecified		For continuous patient monitoring
Pulse oximeter	unspecified		For continuous patient monitoring
3 lead ECG monitor	unspecified		For continuous patient monitoring
Nasal oxygen delivery 2-4l/min	unspecified
Lidocaine 10% spray (Xylocaine)	AstraZeneca		For topical anaesthesia
Lidocaine hydrochloride 2%	unspecified		For topical anaesthesia
Lidocaine gel (Instillagel)	Farco-Pharma, Germany		Alternative products available from other suppliers
Normal saline, sterile 200ml	unspecified		Warm to 30oC
10ml taper-end syringe (x10)	unspecified		For administration of lidocaine
Intravenous cannula 18G	unspecified		For administration of midazolam
Midazolam	unspecified		For sedation
Flumazenil	unspecified		Reversal of benzodiazepine sedation (emergency use only)
60ml taper-end syringes (x4)	unspecified		For normal saline injection and BAL fluid withdrawal. May require connector to attach to the injection port of the bronchoscope
Sterile gauze swab	Vernaid, UK		Alternative products available from other suppliers
Sterile container for BAL fluid	See text and comments		Siliconised glass bottles reduce macrophage adherence. Alternatively, 50ml centrifuge tubes may be used (total capacity 200ml)
Sigmacote	Sigma, UK	SL2	Only if siliconised glass bottles used. NB: Harmful and flammable. If used, follow precautions detailed in manufacturer’s MSDS
Centrifuge	unspecified		At least 4x50ml tube capacity. Refrigeration to 4oC preferred.
Shandon Cytospin centrifuge	Thermo Scientific, UK		For differential count only
RPMI 1640 medium with L-glutamine	Sigma, UK	R8758	Alternative products available from other suppliers
Fetal bovine serum	Sigma, UK	F6178	Alternative products available from other suppliers
Penicillin-Streptomycin	Sigma, UK	P4333	Alternative products available from other suppliers
Amphotericin B	Sigma, UK	A2942	Alternative products available from other suppliers
Tissue culture plates	Greiner Bio-One, UK	662160	Alternative products available from other suppliers
Glass microscope slides	unspecified		For differential count only
Shandon cytofunnel	Thermo Scientific, UK	A78710003	For differential count only
Shandon cytoclip	Thermo Scientific, UK	59910052	For differential count only
Hemacolor staining set (fixative, red and blue reagents)	Merck, Germany	111661	Use according to manufacturer’s instructions