Bestemmelse av gass-fase Acidities av Oligopeptides
Summary
Bestemmelsen av gassfase-acidities av cystein-inneholdende oligopeptider er beskrevet. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer. De relative acidities av peptidene blir målt ved hjelp av kollisjon-indusert dissosiasjon eksperimenter, og de kvantitative acidities fastlegges ved hjelp av utvidede Cooks kinetisk metode.
Abstract
Aminosyre rester ligger på forskjellige posisjoner i foldede proteiner ofte viser ulike grader av acidities. For eksempel er en cysteinrest lokalisert ved eller nær N-enden av en heliks ofte mer surt enn det på eller nær C-terminus 1-6. Selv om omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptidene er blitt gjennomført i den kondenserte fase, spesielt i vandige oppløsninger 6-8 er resultatene ofte komplisert av løsemiddel effekter 7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter har blitt minimalisert 9,10. For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø.
Vi presenterer en metode for å måle acidities av oligopeptider i gass-fase. Vi bruker en cystein-holdig oligopeptide, Ala 3 CysNH <sub> 2 (A 3 CH), slik modellen forbindelsen. Målingene er basert på de veletablerte utvidet Cooks kinetisk metode (figur 1) 11-16. Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel-kvadrupol massespektrometer tilkobles med en electrospray ionisering (ESI) ion kilde (figur 2). For hvert peptid prøve, blir flere referansepunkter syrer valgt. De referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. En oppløsning av blandingen av peptidet og et referanse-syre innføres i massespektrometeret, og en gass-fase proton-bundet anionisk klynge av peptid-referanse syre dannes. Proton-bundet klyngen er masse isolert og deretter fragmentert via kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter. De resulterende fragment ion abundances er analysert ved hjelp av et forhold mellom acidities og klyngen ion dissosiasjon kinetikk. Den gass-fase surhet av peptidet er da obtainert ved lineær regresjon av termo-kinetiske tomter 17,18.
Fremgangsmåten kan anvendes på en rekke ulike molekylære systemer, inklusive organiske forbindelser, aminosyrer og deres derivater, oligonukleotider og oligopeptider. Ved å sammenligne de gass-fase acidities målt eksperimentelt med de verdiene som er beregnet for forskjellige conformers kan konformasjonsendringer virkninger på acidities evalueres.
Introduction
De acidities av aminosyrer er blant de viktigste termokjemiske egenskaper som påvirker strukturene, den reaktivitet, og folding-utfolder prosesser av proteiner 9,19. Individuelle aminosyrer ofte viser ulike effektive acidities avhengig av deres steder i proteiner. Spesielt rester ligger i de aktive setene viser ofte betydelig perturberte acidities. Ett slikt eksempel er cysteinrest bosatt i de aktive områder av thioredoxin super-familien av enzymer 20,21. Den aktive sete cystein er unormalt surt forhold til de i utfoldet proteiner 3-5. Det har vært antydet at det skruelinjeformede konformasjon kan ha et betydelig bidrag til den uvanlige surhet. Det er omfattende eksperimentelle studier på syre-base-egenskaper av peptider gjennomføres i oppløsninger, spesielt i vandige oppløsninger 2,6-8. Resultatene ble ofte komplisert av løsemiddel effekter7. Faktisk er mesteparten av de aktive seter i proteiner lokalisert nær den indre område hvor løsemiddel effekter minimaliseres 9,10.
For å forstå iboende syre-base-egenskaper av peptider og proteiner, er det viktig å utføre studiene i et oppløsningsmiddel-fritt miljø. Her introduserer vi en massespektrometri-basert metode for bestemmelse av gass-fase surhet. Denne tilnærmingen er omtalt som den utvidede Cooks kinetisk metode. Denne metoden har blitt vellykket anvendt for et bredt utvalg av kjemiske systemer for bestemmelse av forskjellige termokjemiske egenskaper, så som gassfase-surhet, proton affinitet, metallionet affinitet, elektronet affinitet, og ioniseringsenergien 11-15, 22-26. Vi har brukt denne metoden for å bestemme gass-fase acidities av en serie med oligo cystein-polyalanine og cystein-polyglycine peptider 17,18,27. Disse studiene viser at N-terminal cystein peptides er betydelig surere enn de tilsvarende C-terminale seg. De høye acidities av det tidligere er trolig på grunn av de spiralformede konformasjonsforandringer effekter der tiolatanion er sterkt stabilisert av samspillet med helix makro-dipol. På grunn av den ikke-flyktige og termisk labile naturen av peptider, er den kinetiske metode den mest praktiske tilnærmingen finnes idag for å produsere rimelig nøyaktig syre-base termokjemiske mengder av peptidene 28.
Den generelle ordningen og ligningen forbundet med den kinetiske metode er vist på figur 1. Fastsettelsen av gass-fase surhet av et peptid (AH) starter med dannelsen av en serie av proton-bundet cluster anioner, [A • H • En i] ¯ (eller [A ¯ • H + • Å i ¯] ¯), i ionekilden region av massespektrometer, hvor A og A i ¯ ¯ er deprotonert former av peptidet ogreferanse syrer, henholdsvis. De referanse syrer er organiske forbindelser med kjente gass-fase acidities. Referansepunktene syrer bør ha strukturer som ligner hverandre (men ikke nødvendigvis lik den for peptid). Likheten av strukturene mellom referanse syrer sikrer likheten av entropies av deprotonering blant dem. Proton-bundet klynge anioner er valgt masse og collisionally aktivert og deretter dissosiert med sammenstøt-indusert dissosiasjon (CID) eksperimenter for å gi det tilsvarende monomere anioner, A og A i ¯ ¯, med hastighetskonstanter av K og k i, henholdsvis, er vist i figur 1a. Dersom sekundære fragmentations er ubetydelige, overflod forholdet av CID-fragment-ioner, [A ¯] / [Å i ¯], representerer et tilnærmet mål for forholdet mellom hastighetskonstantene, k / k i. Under forutsetning av at det ikke er omvendt aktiion barrierer for både dissosiasjon kanaler, CID produkt ion forgreningsforhold, Ln [A •] / [Å i ¯], vil bli lineært korrelert til gassfase-surhet av peptidet (Δ syre H) og de av referanse-syrer (Δ syre H-i), som vist i figur 1b. I denne ligningen er Δ syre H avg gjennomsnittlig gass-fase surhet av referanse syrer, er Δ (Δ S) entropi sikt (som kan antas konstant dersom referanse syrer er strukturelt lik hverandre), er R universelle gasskonstanten og T eff er den effektive temperaturen i systemet. Den effektive temperatur er en empirisk parameter som avhenger av flere eksperimentelle variabler, inkludert kollisjonsenergien.
Verdien av gassfaseprosessen surhet bestemmes ved å konstruere to sett av termo-kinetiske plott. Det første settet er obskje ved å plotte ln ([A ¯] / [A i ¯]) mot Δ syre H i – Δ syre H gj.snitt, som vist i figur 4a. Lineær regresjon vil gi et sett med rette linjer med bakkene i X = 1 / RT eff og fanger av Y = – [Δ syre H – Δ syre H avg] / RT eff – Δ (Δ S) / R. Det andre settet av tomter blir oppnådd ved å plotte de resulterende avskjærer (y) fra det første sett mot de tilsvarende bakker (X), som vist i figur 4b. Lineær regresjon produserer en ny linje med en helling på Δ syre H – Δ syre H avg og en fange av Δ (Δ S) / R. Verdien av Δ syre H blir deretter oppnådd fra helling og entropi sikt, Δ (Δ S), innhentesskjæringspunktet.
Forsøkene er utført ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer sammenknyttet med en elektrospray ionisering (ESI) ionekilde. Et skjematisk diagram av massespektrometer er vist i figur 2.. De CID eksperimenter utføres etter masse å velge de proton-bundet cluster anioner med den første kvadrupol enhet og gi dem muligheten til å gjennomgå kollisjoner med argon atomer lekket inn i kollisjonen kammer som er holdt ved et trykk på rundt 0,5 mTorr. De dissosiasjon produktet ioner er masse analysert med den tredje kvadrupol enhet. CID spektra er registrert på flere kollisjon energier med m / z serien bred nok til å dekke alle mulige sekundære fragmenter. De CID produkt ion intensiteter måles ved å sette instrumentet i den valgte reaksjon overvåking (SRM) modus der skanningen er fokusert på utvalgte produktområdene ioner. De CID eksperimenter utføres på fire forskjellige kollisjon energier, tilsvarendecenter-of-masse energi (E cm) på 1,0, 1,5, 2,0, og 2,5 eV, henholdsvis. Senter-til-masse energien beregnes ved hjelp av ligningen: E = E cm lab [M / (M + m)], hvor E er lab kollisjonsenergien i laboratoriet ramme, m er massen av argon, og M er massen av den proton-bundet klynge ion.
I denne artikkelen bruker vi oligopeptide Ala 3 CysNH 2 (A 3 CH) som modell sammensatte. C-terminalen er amidert, og tiolgruppe (SH) av cystein-rester vil være det sure område. Valget av egnet referanse syrer er avgjørende for en vellykket måling av gassfase-surhet. Den ideelle referanse syrer er strukturelt lik (til hverandre) organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær at av peptider. For peptid A 3 CH, halogenerte seks carboxylic syrer er valgt som referanse-syrer. De seks referanse syrer er kloreddiksyre (MCAH), bromeddiksyre (mbah), Difluoreddiksyre (DFAH), dikloreddiksyreanhydrid syre (DCAH), dibromoacetic syre (DBAH), og trifluoreddiksyre (TFAH). To av dem, vil DFAH og mbah, benyttes til å illustrere den protokoll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den vellykkede måling av gassfase-surhet av et peptid avhengig i stor grad av valget av egnede syrer referanse. Den ideelle referanse syrer er strukturelt ligner organiske forbindelser med veletablerte gass-fase surhet verdier. Referansepunktene syrer bør ha lignende strukturer til hverandre. Dette vil sikre en lignende entropi av deprotonering for hvert av referanse syrer i settet. Referansepunktene syrer bør ha surhet verdier nær dem av peptidene. For kortere cystein-inneholdende oligopeptider med amidert C-termin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Mass Spectrometer | Varian | 1200 L and 320 L | |
| Chloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 402923 | |
| Bromoacetic acid | Sigma-Aldrich | B56307 | |
| Difluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 142859 | |
| Dichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | D54702 | |
| Dibromoacetic acid | Sigma-Aldrich | 242357 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 |
References
- Forsyth, W. R., Antosiewicz, J. M., Robertson, A. D. Empirical relationships between protein structure and carboxyl pKa values in proteins. Proteins: Struct. Funct. Genet. 48 (2), 388-403 (2002).
- Huyghues-Despointes, B. M. P., Scholtz, J. M., Baldwin, R. L. Effect of a single aspartate on helix stability at different positions in a neutral alanine-based peptide. Protein Sci. 2 (10), 1604-1611 (1993).
- Takahashi, N., Creighton, T. E. On the Reactivity and Ionization of the Active Site Cysteine Residues of Escherichia coli Thioredoxin. Biochemistry. 35 (25), 8342-8353 (1996).
- Gan, Z. R., Sardana, M. K., Jacobs, J. W., Polokoff, M. A. Yeast thioltransferase – the active site cysteines display differential reactivity. Archives of Biochemistry and Biophysics. 282 (1), 110-115 (1990).
- Philipps, B., Glockshuber, R. Randomization of the Entire Active-site Helix alpha 1 of the Thiol-disulfide Oxidoreductase DsbA from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (45), 43050-43057 (2002).
- Joshi, H. V., Meier, M. S. The effect of a peptide helix macrodipole on the pKa of an Asp side chain carboxylate. J. Am. Chem. Soc. 118, 12038-12044 (1996).
- Kortemme, T., Creighton, T. E. Ionization of cysteine residues at the termini of model α-helical peptides. Relevance to unusual thiol pKa values in proteins of the thioredoxin family. J. Mol. Biol. 253 (5), 799-812 (1995).
- Gallo, E. A., Gellman, S. H. Effect of a C-Terminal Cationic Group on the Competition between α-Helical Turn and β-Turn in a Model Depsipeptide. J. Am. Chem. Soc. 116 (25), 11560-11561 (1994).
- Honig, B., Nicholls, A. Classical electrostatics in biology and chemistry. Science. 268 (5214), 1144-1149 (1995).
- Warshel, A. Electrostatic basis of structure-function correlation in proteins. Acc. Chem. Res. 14 (9), 284-290 (1981).
- Cooks, R. G., Patrick, J. S., Kotiaho, T., McLuckey, S. A. Thermochemical determinations by the kinetic method. Mass Spectrom. Rev. 13 (4), 287-339 (1994).
- Cooks, R. G., Koskinen, J. T., Thomas, P. D. The kinetic method of making thermochemical determinations. J. Mass Spectrom. 34 (2), 85-92 (1999).
- Cheng, X., Wu, Z., Fenselau, C. Collision Energy Dependence of Proton-Bound Dimer Dissociation: Entropy Effects, Proton Affinities, and Intramolecular Hydrogen-Bonding in Protonated Peptides. J. Am. Chem. Soc. 115 (11), 4844-4848 (1993).
- Cerda, B. A., Wesdemiotis, C. Li+, Na+, and K+ Binding to the DNA and RNA Nucleobases. Bond Energies and Attachment Sites from the Dissociation of Metal Ion-Bound Heterodimers. J. Am. Chem. Soc. 118 (47), 11884-11892 (1996).
- Cooks, R. G., Wong, P. S. H. Kinetic Method of Making Thermochemical Determinations: Advances and Applications. Acc. Chem. Res. 31 (7), 379-386 (1998).
- Armentrout, P. B. Entropy Measurements and the Kinetic Method: a Statistically Meaningful Approach. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11 (5), 371-379 (2000).
- Ren, J., Tan, J. P., Harper, R. T. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides I: A3,4CSH and HSCA3,4. J. Phys. Chem. A. 113 (41), 10903-10912 (2009).
- Morishetti, K. K., Huang, B. D. S., Yates, J. M., Ren, J. Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyglycine Peptides: The Effect of the Cysteine Position. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (4), 603-614 (2010).
- Fersht, A. . Structure and mechanism in protein science. , (1999).
- Martin, J. L. Thioredoxin-a fold for all reasons. Structure. 3 (3), 245-250 (1995).
- Carvalho, A. P., Fernandes, P. A., Ramos, M. J. Similarities and Differences in the Thioredoxin Superfamily. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 91 (3), 229-248 (2006).
- Bouchoux, G., Sablier, M., Berruyer-Penaud, F. Obtaining Thermochemical Data by the Extended Kinetic Method. J. Mass Spectrom. 39 (9), 986-997 (2004).
- Bouchoux, G., Desaphy, S., Bourcier, S., Malosse, C., Bimbong, R. N. B. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Arginine. J. Phys. Chem. B. 112 (11), 3410-3419 (2008).
- Bouchoux, G., Bimbong, R. N. B., Nacer, F. Gas-Phase Protonation Thermochemistry of Glutamic Acid. J. Phys. Chem. A. 113 (24), 6666-6676 (2009).
- Zheng, X., Cooks, R. G. Thermochemical Determinations by the Kinetic Method with Direct Entropy Correction. J. Phys. Chem. A. 106 (42), 9939-9946 (2002).
- Jones, C. M., Bernier, M., Carson, E., Colyer, K. E., Metz, R., Pawlow, A., Wischow, E. D., Webb, I., Andriole, E. J., Poutsma, J. C. Gas-phase acidities of the 20 protein amino acids. Int. J. Mass Spectrom. 267 (1-3), 54-62 (2007).
- Tan, J. P., Ren, J. Determination of the Gas-Phase Acidities of Cysteine-Polyalanine Peptides Using the Extended Kinetic Method. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18 (2), 188-194 (2007).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrom. Rev. 16 (4), 201-217 (1997).
- Gutte, B. . Peptides: Synthesis, Structures, and Applications. , (1995).
- Barany, G., Merrifield, R. B. Solid-phase peptide synthesis. The Peptides. 2, 1-284 (1979).
- Chan, W. C., White, P. D. . Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach. , (2000).
