Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em Drosophila Durante a infecção bacteriana, bem como a capacidade das moscas de montar uma resposta imune pela sobrevivência de monitorização, a carga bacteriana e, em tempo real, a actividade de um regulador chave da imunidade inata, NFkB.

Resumo

A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos ¹ e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster ^2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto ^3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada ^4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema ^5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.

Protocolo

Este protocolo utiliza duas configurações (Figura 1) para adquirir quatro leituras diferentes recolhidos de moscas submetidos a uma infecção bacteriana. Estas saídas incluem 1) sono / vigília comportamento, 2) O resultado da sobrevivência, 3) a carga bacteriana em tempo real, e 4) em tempo real a medição de actividade de NFkB repórter in vivo. Em combinação com as ferramentas genéticas que estão disponíveis em Drosophila, estas medições fornecem uma visão mecanicista para a ligação molecular entre a função imunológica e no comportamento.

1. Atividade medida Locomotor e do sono nas moscas

1. A con....

Resultados

1. Infecção promove o sono. Neste exemplo, Canton-S (CS) moscas do tipo selvagem e moscas mutantes desprovidos de um gene NFkB, Relish (Rel ^{E20) 14,} foram carregados em dois DAM2 monitores de actividade (n = 32 para cada genótipo) e infectadas, como descrito acima. As moscas foram mantidas em luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano no comportamento e infecção ^2,7,8. Os mutantes foram isogenized ^E20 Rel de CS, tal como descrito previamente ^11. Amb.......

Discussão

Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que envolvem uma med.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome de material	Companhia	Número de catálogo	Comentários
			Equipamento
Incubadoras	Percival Scientific, Inc.	I30BLLC8 I36VLC8	Qualquer incubadora capaz de executar luz programada / horários de temperatura é adequada.
Drosophila ATIVIDADE Monitores	Trikinetics Inc., Waltham, MA	DAM2	Conforme já descrito 6, este sistema requer uma interface de computador, software e outros acessórios.
Pirex de vidro Tubos	Trikinetics Inc., Waltham, MA	PGT-5x65
De cintilação de microplacas e contador de luminescência	Perkin Elmer	TopCount NXT 12 detector	Qualquer leitor de microplacas capaz de detecção de luminescência pode ser utilizado para este tipo de ensaio de repórter. TopCount contém múltiplos detectores e um empilhador automático, que é capaz de ser programado para ler continuamente a partir de múltiplas placas.
FluorChem 8900	Alpha Innotech		Imagem de culturas bacterianas é opcional; qualquer sistema de imagem digital com capacidade de luz visual é suficiente.
Micropipeta Puller	Tritech Research, Inc.	Narishige PC-10
			Abastecimento
Borosilicato capilares de vidro	Precision Instrument Inc. mundo	1B100F-4
Seringa 3 ml	Fisher Scientific	BD 305482
Agulhas de seringa	Fisher Scientific	BD 305196	18 G - corte da ponta da agulha, para evitar danos na tubagem.
Tubulação do silicone, id (0,030 ") od (0,065") Espessura da parede (0,018 ")	VWR	60985-706	Utilizado para a fixação de agulhas capilares de vidro para uma seringa
Torneira de 3 vias	Empresa americana Pharmaseal	K75
Kontes Pellet Pilão Motor Cordless	Fisher Scientific	K749540-0000
Kontes Pellet Pilão	Fisher Scientific	K749521-1590
Bolas de vidro 3 milímetros	VWR	26396-630
Microplate Microlite 1 +	Thermo Scientific	7571	Select placas de 96 poços que são apropriados para luminescência - devem ser opacas.
Topseal-A Microplacas :96-bem	PerkinElmer	6005185	Microplaca Press-On Film vedação adesiva
D-luciferina, sal de potássio	BioTechnology Gold, Inc.	LUCNA
			Software
Insomniac2	Disponíveis mediante solicitação aos autores	personalizado, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College)	Matlab baseado em software que tem sido utilizada rotineiramente para a análise de sono 2,6,11
Drosonex	Disponíveis mediante solicitação aos autores	personalizado, escrito por Thomas Coradetti (Software Calçada)	Um PC MSVC6 programa utilizado para a análise de sobrevivência a partir de arquivos de dados brutos coletados com oTrikinetics sistema
Photoshop CS3	Adobe		Útil para a obtenção do número de ufc / placa a partir de imagens digitais (opcional)