Изоляция первичных меланоцитов-подобных клеток из Сердца Mouse
Summary
В этом протоколе, ж е обнаружен новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют мерцательная аритмия вызывает у мышей.
Abstract
Мы определили новый население меланоцитов-подобных клеток (также известный как сердечные меланоцитов) в сердцах мышей и людей, которые способствуют предсердий триггеров аритмии у мышей. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от мыши сердцах, что мы, полученных от тех, предназначены для защиты новорожденных мышиных кардиомиоцитов. Для того чтобы получить здоровые сердечные меланоциты, пригодные для более широкого зажима патч или биохимических исследований, мы разработали изысканный процедуру выделения и покрытие сердечные меланоциты, основанные на тех, которые изначально предназначены для защиты кожных меланоцитов. Изысканный процедура демонстрируется в данном обзоре и производит большее количество здоровых меланоцитов-подобных клеток, которые могут быть покрыты как чисто населения или с кардиомиоцитов.
Introduction
Мы недавно обнаружен новый популяции клеток в сердце мышей и людей, которые выражают меланин-синтеза ферментов и морфологически напоминают кожные меланоциты. Мы назвали "сердечные меланоциты 'Эти клетки и обнаружили, что они присутствуют в анатомических мест, откуда мерцательная аритмия триггеры часто происходят в организме человека. Мы также обнаружили, сердечные меланоциты способствовать предсердий аритмий у мышей с зародышевой линии удаления DCT. Сердечные меланоциты редко распределяется по всему мыши атриум, где они составляют менее 0,1% всех предсердных клеток. Для исследования электрических и биологические свойства сердечных меланоцитов мы разработали процедуру, чтобы изолировать их от сердца мыши, используя Cre-индуцируемый меланоцит специфические маркеры. Наша первоначальная процедура была разработана с тем, которые используются для изоляции новорожденных мышиных кардиомиоцитов и дало очень небольшое количество клеток, пригодных для локальной фиксации записей или ПЦР-анализа. Тем не менее, для улучшения исцелитьй и жизнеспособность сердечной меланоцитов, для более глубокого электрофизиологические анализ или биохимические исследования, мы разработали изысканный процедуру от тех, предназначены для защиты кожных меланоцитов. Процедура, описанная и показано в этом обзоре имеет то преимущество, что производство здоровых сердечных меланоцитов, которые могут быть покрыты в виде чистого населения или кардиомиоцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сердечные меланоциты находятся в анатомических местах в сердце, которые обычно приводят к мерцательной аритмии триггеров. К таким регионам относятся легочные вены, атриовентрикулярным кольцо, заднюю левого предсердия и овальное отверстие (рисунок 4). Чтобы понять роль этих к?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института награждения Здоровье R01 HL105734 к VVPMDL поддерживается, в частности, Национального института исследований в области здравоохранения Карьера премии K08 HL094748. VVP является инновационный научный сотрудник Американской ассоциации сердца поддержке гранта 11IRG900384.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comment |
| MCDB 153 | Sigma-Aldrich | M7403 | Dissolve in: Water |
| DPBS, no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190136 | Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Sodium Bicarbonate, or Sodium Bicarbonate Solution, 7.5% | Sigma-Aldrich | S5761 or S8761 | Water Stock Conc.: 1X Working Conc.: 1X |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140163 | Stock Conc.: 100X Working Conc.: 1X |
| Fetal Bovine Serum | Life Technology | Certified | Working Conc.: 4% |
| TPA | Sigma-Aldrich | P1585 | DMSO Stock Conc.: 3.2 μM Working Conc.: 32 nM |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | DPBS Stock Conc.: 0.1 mg/ml Working Conc.: 1 μg/ml |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma-Aldrich | D0627 | DPBS Stock Conc.: 0.5 mM Working Conc.: 5 μM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 10 mM
acetic acid Stock Conc.: 1 mg/ml Working Conc.: 5 μg/ml |
| Basic FGF | BD Biosciences | 354060 | Water Stock Conc.: 4 ng/μl Working Conc.: 4 ng/ml |
References
- Hornyak, T. J., et al. Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).
- Yonetani, S., et al. In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle. J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).
- Levin, M. D., et al. Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers. J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).
- Patel, V. V. Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).
- Sviderskaya, E. V., et al. Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells. FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).
- Sviderskaya, E. V., et al. P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation. J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).
- Cook, A. L., et al. Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3. J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).
- Fang, D., et al. Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).
- Brito, F. C., et al. Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).
- Yajima, I., et al. The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color. Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).
