Summary
El método se describe el aislamiento y caracterización de células humanas de la Pulpa Dental madre (hDPSCs) mediante el uso de cualquiera de los dos
Abstract
Introduction
Las células madre son células clonigénicas que poseen dos características notables, conocidas como multi-potencia y auto-renovación 15. Entre todas las células madre con potencias diferentes replicativos, las células madre dentales como las células madre postnatales han llamado la atención en los últimos años debido a su accesibilidad, la plasticidad y alta capacidad proliferativa en comparación con otras células madre adultas 16. Característicamente, similar a las células madre mesenquimales, células madre de pulpa dental están adheridas las células clonogénicas que tienen la capacidad de diferenciación en múltiples mesénquima y / o no-mesénquima linajes, tanto in vitro como in vivo. 1-8,17,18 DPSCs se identifican por su expresión negativa de antígenos hematopoyéticos (por ejemplo, CD45, CD34, CD14), y la expresión positiva de CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 y STRO 1-19,20.
Fácil potencial obtenida con un mínimo de dolor y morbilidad hacer DPSCs humanos como una valiosafuente capaz de MSCs en comparación con las fuentes comunes, tales como células madre mesenquimales de la médula ósea 21. En general, DPSCs se han aislado por cualquier método de derivación, es decir, la migración de las células madre a partir de explantes de tejido de pulpa (DPSC-OG) 22-24, y / o mediante digestión enzimática (DPSC-ED) 4,6,25. Estudios anteriores han demostrado que el método de aislamiento y las condiciones de cultivo pueden inducir diferentes poblaciones o linajes bajo pasajes in vitro 26,27. En el caso de los dientes permanentes (pDPSCs), Huang et al puesto de manifiesto que enzimáticas pDPSCs digeridos tienen un mayor potencial de proliferación en comparación con los DPSCs superado. 26 Por otra parte, en el caso de los dientes deciduos (dDPSCs), se demostró que STRO-1 y CD34 marcadores expresa más en DDPSC-DE en comparación con DDPSC-OG. Además, DDPSC-ED mostraron un aumento significativo en la tasa de mineralización definida osteo / odonto medio. 27 Por lo tanto, debido al gran potencial de DPSCs en regenerative medicina, más estudios se requerirán para un mejor entendimiento de las posibles poblaciones diferentes que se derivan de diferentes métodos de aislamiento.
Aquí, era intento de introducir de manera fácil extracción de la pulpa, mediante el uso de un solo paso disco de diamante dental para facilitar el proceso de extracción de la pulpa. Por otra parte, tras el aislamiento de las células madre derivadas de la pulpa mediante la aplicación de métodos o ED OG, propiedades generales y capacidad de diferenciación entre dos grupos también fueron investigados.
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Protocol
1. Preparar la solución de enzima y medio de proliferación (PM)
- Hacer colagenasa tipo I Solución: Pesar colagenasa tipo I (12 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a -20 ° C hasta su utilización.
- Hacer la solución de dispasa: Pesar dispasa (16 mg / ml) y se disuelven en 1 ml de PBS y el filtro utilizando un filtro de 0,2 micras jeringa. A continuación, colóquelo tubo de 15 ml y conservarse a 4 ° C hasta su utilización.
- Hacer solución de enzima: Añadir 1 ml de colagenasa tipo I soluciones (12 mg / ml) y 1 ml de soluciones de dispasa (16 mg / ml) en el 2 ml de PBS estéril que contiene 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina. La concentración total de dispasa y colagenasa I en el volumen final debe ser de 4 mg / ml y 3 mg / ml, receptivamente. Luego, alícuota de este volumen en a cuatro tubo de 15 ml, conteniendo cada uno 1 ml de solución de enzima. Cada tubo se podría utilizar para la digestión de pulpa uno.
- Hacer la disolución de lavado: Añadir 100 mg / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina en PBS.
- Hacer que los medios básicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10% y 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina.
- Hacer que los medios Proliferación (PM): modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml estreptomicina, 0,25 mg / ml de anfotericina B.
- Hacer que los medios odontogénicos: modificación Alfa de medio de Eagle (α-MEM) suplementado con FBS al 10%, 100 mM ácido L-ascórbico 2-fosfato, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 0,01 mM dexametasona, 5 mM β-glicerol fosfato, fosfato monopotásico 1,8 mM.
2. Preparar Tejido Humano Pulpa Dental para Isolatio célula madre de la pulpa dentaln
- Normales de los terceros molares humanos se obtuvieron de los adultos (21-29 años de edad) en la Clínica Dental del Imam Ali bajo aprobadas por la junta de revisión institucional (IRB).
- Los dientes se coloca en el medio de base (α-MEM suplementado con FBS al 10%) y se transfirieron en laboratorio a 4 ° C.
- Bajo la condición estéril, trabajando dentro de una campana de flujo laminar biohazard, set-up se hizo uno de 100 mm placas de Petri para cada diente para ser procesado. Superficies de los dientes se limpiaron por 70% de etanol.
- Mientras se trabaja en una de las placas Petri, diente se mantuvo por fórceps dentales y una hoja de bisturí fue utilizado para limpiar los desechos y el ligamento periodontal en las raíces.
- Unión cemento-esmalte se redujo lentamente mediante el uso de disco esterilizado dental para revelar la cámara pulpar. Se debe considerar que el proceso de corte debe llevarse a cabo lentamente para reducir el sobrecalentamiento del tejido dental.
- El tejido pulpar se separó suavemente de la corona y la raíz. Tejido de la pulpa se cortó en trozos pequeños con la ayuda de una cuchilla de escalpelo.
3. Aislamiento Humano Pasta Dental
- Tejidos de la pulpa fueron sometidos a la disociación enzimática de la pulpa o fruto directo de células de explantes de tejidos de celulosa para el aislamiento de hDPSCs.
- Disociación enzimática del tejido pulpar:
- Pequeños trozos de tejidos de la pulpa se transfiere a la solución de enzima durante 1 hora a 37 ° C. Vortex cada 30 minutos para ayudar a romper el tejido.
- Después, los grandes agregados celulares se retiraron y solo suspensiones de células se obtuvieron haciendo pasar las células a través de un filtro de células 70-m.
- Solo suspensiones de células se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 min a temperatura ambiente.
- Los sobrenadantes se pipetearon cuidadosamente apagado y el sedimento se resuspendió en 1 ml de medio de proliferación (PM). (Nota: FBS en medio de proliferación terminar enzimática disasociación.)
- Solo suspensiones de células de la pulpa dental se sembró en 25 cm matraz de cultivo con 2 PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO 2.
- El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta la confluencia celular se logró.
- Consecuencia directa de células de explantes de tejido pulpar:
- Tejido de la pulpa fue picado en 1-2-mm fragmentos, y cada pieza se colocó en 25-cm 2 frascos de cultivo con PM y después se incubó a 37 ° C en 5% de CO 2. Se debe considerar que el volumen total de la PM para excrecencia de célula debe ser compatible con la unión de piezas de pasta de excrecencia celular adicional (2-3 ml por matraz).
- El medio se cambió después de excrecencia se observó.
- Las células no caben en confluencia se subcultivaron en una relación de 1:4 (paso 1).
4. Inmunofenotipificación
- 250.000 células /tubo de ambos tipos de células en el paso 3 se incubaron por PE o FITC-conjugado con anticuerpos anti-humanos con sus isotipos durante 30 min a 4 ° C en un lugar oscuro. (Nota:. La concentración de anticuerpos se aplicó de acuerdo con el protocolo de fabricación)
- Después del tiempo de incubación, 100 l de PBS o solución de FACS dilución se añadió a cada tubo y se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 min en un lugar oscuro.
- Se eliminaron los sobrenadantes y sedimentos se resuspendieron en 100 l de PBS o dilución FACS en lugar oscuro.
- Targeted marcadores de superficie (marcadores CD) fueron evaluados por BD FACSCalibur.
5. La inducción de la diferenciación de las células en DPSCs mineralizadas y cuantificado de Ensayo Rojo de alizarina S
- DPSCs que fueron obtenidos por cualquiera de disociación enzimática de tejido de la pulpa (conocido como DPSC-ED) o excrecencia celular directa de explantes de tejido de la pulpa (DPSC-OG) fueron sub-cultivadas durante 3 pasajes.
- Lat Paso 3, las células se sembraron en una placa de 6 pocillos a 5.000 células / pocillo.
- En la confluencia de 60%, medio odontogénico se sustituye por PM convencional. Tres pocillos se mantuvo como un control negativo mediante la adición de medio de crecimiento.
- Media cambian cada 3 días hasta el día 21.
- Al día 21, se lavaron las células con PBS y se fijaron por 1 ml / pocillo de 10% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente.
- Entonces paraformaldehído se pipeteó cuidadosamente y las células se lavaron 3 veces (5-10 min para cada tiempo) con agua destilada H 2 O. (Nota: Evite perturbar la monocapa.)
- Después del lavado, 1 ml / pocillo rojo de alizarina S se añadieron durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Las células se lavaron por H2O desionizada cuatro veces (5 min por cada vez con agitación suave) para eliminar cualquier adicional rojo de alizarina.
- 1 ml / pocillo de H 2 O se añadieron a evitar que las células de secado.
- Las placas se supone que ins visualespección y / o adquisición de la imagen.
- Para el ensayo de cuantificación de rojo de alizarina S, H 2 O se sustituye por 1 ml de 10% de ácido acético a cada pocillo de 6-así placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente con agitación.
- Entonces, monocapa de células / pocillo fueron rascado y tanto el ácido acético y las células se transfirieron a los separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos. (Nota:. Cada pozo debe ser separado de transferencia en un tubo de ensayo es decir, tres pozos y tres pozos de control para cada grupo de ED & OG)
- Los tubos se agitaron vigorosamente durante 30 segundos.
- Calentar a 85 ° C durante 10 min. (Nota: para evitar la evaporación, los tubos se sellaron con parafilm.)
- Después del calentamiento, los tubos se transfirieron a hielo durante 5 min. (Nota: Los tubos no deben abrirse hasta llegar a ser enfriado.)
- Las suspensiones se centrifugaron a 20.000 xg durante 15 min. Mientras centrifugación, la alizarina normas rojas se hicieronarriba.
Estándar de rojo de alizarina S se prepararon diluyendo en primer lugar el tampón de dilución y utilizado para la fabricación de 2 veces la dilución sobre la base de la mesa.
| De gama alta concentración de colorante | Concentración de colorante de bajo rango | ||||||||||||
| 2 mM | 1 mM | 500 mM | 250 mM | 125 mM | 62,5 mM | 31,3 mM | 15,6 mM | 7,8 mM | 3,9 mM | 1,9 mM | 0,9 mM | 0,4 mM | En blanco |
- Después de la centrifugación, 1 ml de sobrenadante / tubo se transfirieron a nuevos separados 1,5 ml de microcentrífuga tubos.
- El pH se neutralizó con ~ 375 l 10% De hidróxido de amonio por tubo. (Nota: la rabia pH debe ser 4.1-4.5).
- 150 ml de estándar y muestras (incluye pruebas por separado y controles) se añadieron en un opaco pared, fondo transparente de 96 pocillos.
- La absorbancia se leyó a 405 nm y los valores de la DO de las muestras se compararon con trama estándar para el análisis adicional.
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Representative Results
- DPSCs que fueron obtenidos por disociación enzimática (DPSC-ED) se muestran aquí, en días 10, 15,18 (Figura 1). Las colonias iniciados para formar en casi 3 a 5 días después del aislamiento.
- DPSCs superado (DPSC-OG) se muestran en la Figura 2 en el día 5, 10, 13 y 18. Similares a fibroblastos células comenzaron a migrar de tejido de la pulpa en el matraz por paralelo ordenar por casi 5 días después de la siembra.
- DPSCs en el paso 3 con ambos métodos se muestran en la Figura 3. Ambos tipos de DPSCs eran casi del mismo tamaño y morfología.
- Inmunofenotipificación resultados en DPSC-ED y DPSC-OG (Figura 4). Estos resultados indican la presencia de marcadores de células madre mesenquimales, tales como CD44, CD73, CD105 y CD90, y la ausencia de marcadores hematopoyéticos y endotelial tales como CD34, CD45 y CD11b . Las expresiones de CD105 y CD146 (perivascular marcador) fueron más en DPSC-OG en comparación con DPSC-ED.STRO-1 fue negativo en ambos grupos. (Líneas azules que se refiere a OG grupo, mientras que las líneas rojas se refiere a una ED, líneas amarillas indican isotipos.)
- Morfología de rojo de alizarina S y resultados de cuantificación para la evaluación de la formación de tejido mineralizado en DPSC-ED y DPSC OG-en el día 21 se muestran en la Figura 5. El color rojo más absorbente de la deposición de calcio más. Estos resultados indican más depósito de calcio en diferenciada DPSC-ED (d) en comparación con DPSC-OG (c). (Repeticiones por triplicado técnicos) cuantificación de alizarina roja S también se indica el significativo (*) mayor concentración de colorante entre DPSC-DE en comparación con los grupos de OG. (Concentración de colorante también se incrementó significativamente (**, ***) entre las pruebas y controles de cada grupo (ED o OG) que se indican la deposición de calcio después del proceso de diferenciación)
(Notas: Una prueba t pareada análisis se utilizó para determinar las diferencias en lacantidad de matriz mineralizada producida grupos OG ED y después de la inducción de la diferenciación. Los resultados se expresan como media ± SEM. (Significación supone para P <0,05)
- QPCR resultados de la expresión de genes relacionados con odontoblastos y mineralizado-(DSPP) y (MEPE, ALP), respectivamente, en diferenciada DPSC-ED & DPSC OG-se muestran en la Figura 6. Estos resultados indican el importante sobre regulación de ALP y MEPE después de la diferenciación de los grupos de ED y OG. Mientras tanto, las expresiones de ALP y MEPE fueron significativamente mayores en DPSC-ED diferenciada en comparación con el diferenciada DPSC-OG. Sin embargo, no hay ninguna diferencia en la expresión de DSPP en células diferenciadas entre ambos grupos (gen de mantenimiento: Tirosina 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxigenasa activación de la proteína (YWHAZ)). 28
(Nota:. Las QPCR datos se analizaron utilizando el método comparativo CT A pa IRED t-test de análisis se utilizó para determinar las diferencias en la expresión génica entre ED & OG grupos antes y después de la diferenciación, y también entre las células diferenciadas de dos grupos. Los resultados se expresan como media ± SEM. (Significación asumido para P <0,05) (repeticiones por triplicado técnicas)
Figura 1. Enzimática disociado DPSC (DPSC-ED) en el día 10, 15 y 18. Bar Aumento = 200 micras.
Figura 2. Superado DPSCs (DPSC-OG) en el día 5, 10, 13 y 18. Bar Aumento = 200 micras.
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Figura 3. Superado DPSCs (DPSC-OG) y enzimáticos DPSCs digeridos (DPSC-DE) morfologías de paso 3. Bar Aumento = 200 micras. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 4. Histograma superpuesto de inmunofenotipo resultados en DPSC-ED (rojo oscuro) y DPSC-OG (Azul). (Líneas amarillas representan isotipos). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
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Resultados de la Figura 5. Alizarina roja S tinción diferenciado en DPSC-OG (c), y diferenciada DPSC-ED (d). (A) y (b) se refiere a los controles. La cuantificación de ensayo alizarina roja S muestran una absorción más diferenciado colorante en DPSC-DE en comparación con el grupo diferenciado OG (e). Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 6. QPCR resultados de la expresión de genes relacionados con odontoblastos y mineralizado-(DSPP) y (MEPE, ALP), respectivamente, en diferenciada DPSC-ED & DPSC OG-. La expresión de MEPE, ALP, y DSPP en las células diferenciadas en comparación con el control confirmó la diferenciación de ambos grupos en odontoblastos (ac). Estos resultados indican el importante sobre regulación de ALP y MEPE después de la diferenciación de los grupos de ED y OG (a & b). Mientras tanto, las expresiones de ALP y MEPE fueron significativamente mayores en DPSC-ED diferenciada en comparación con el diferenciada DPSC-OG (a & b). Sin embargo, no hay ninguna diferencia en la expresión de DSPP en células diferenciadas de ambos grupos (c) (gen de mantenimiento: Tirosina 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxigenasa activación de la proteína; YWHAZ). Haga clic aquí para ampliar la figura .
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Discussion
Este protocolo describe el proceso de aislamiento y caracterización de hDPSCs de pulpa dental utilizando dos métodos, la disociación enzimática y la consecuencia directa de las células madre a partir de explantes de tejido de la pulpa. Además, la diferenciación in vitro de estas células en odontoblastos, se evaluó por el ensayo cuantitativo rojo de alizarina S & QPCR.
Los protocolos existentes para el aislamiento de tejido de la pulpa de los dientes humanos se habían utilizado diversos instrumentos como pinzas (fórceps hueso) 9, extirpación de agujas 29, 30 cureta Gracey, fresas dentales fisura 4, etc Estos métodos son mucho tiempo, teniendo en cuenta el bajo nivel de sobrecalentamiento de la pulpa por adición de agua continuamente. Sin embargo, en la técnica actual, disco de diamante dental se utiliza para el aislamiento de tejido de la pulpa, que es una forma rápida para cortar diente con mínima contaminación en proceso de un solo paso, y reduce al mínimo el sobrecalentamiento de la pulpa durante un proceso de corte. Por otra parte, un hDPSCsvolver finalmente diferenciarse en odontoblastos que nunca han sido comparados en el caso de los dientes permanentes humanos por objetivo discutido. Evaluación comparativa de hDPSCs diferenciados (grupos de ED & OG) mediante un ensayo cuantitativo Rojo de alizarina S indica el potencial de mineralización de mayor hDPSC-DE en comparación con OG grupo. Estos resultados también confirman por QPCR. DSPP, ALP y MEPE como la mineralización de marcadores regulados hasta después de la diferenciación de odontoblastos en ambos grupos. Por otro lado, las expresiones de MEPE y ALP fueron mayores en diferenciada hDPSC-DE en comparación con el control. De acuerdo con el estudio anterior de los dientes deciduos 27, las células madre derivadas de dientes permanentes o mediante el uso de métodos OG ED aislamiento también exhiben comportamientos similares de diferenciación en las mismas condiciones. Además, para una mejor evaluación comparativa, en este estudio, tanto hDPSC-ED & hDPSC OG-se aislaron a partir de los mismos individuos.
Las expresiones de marcadores de MSC unad la ausencia de marcadores heamatopietic / endotelial identificar ambos tipos de hDPSCs como células madre mesenquimales. Por otro lado, CD 105/146 CD fueron mayores en DPSC-OG en comparación con los grupos de ED. A pesar de la evidencia existente de acuerdo a la presencia de STRO-1 en DPSCs 31, nuestros resultados no mostraron expresión de STRO-1 en ambos grupos. Sin embargo, la diversidad significativa en la expresión de marcadores de superficie en diferentes estudios puede ser debido a las condiciones de cultivo, ya sea como número de paso, la composición de los medios de comunicación, etc, o variaciones interindividuales entre los diferentes donantes. La ausencia de STRO-1 en ambos grupos puede indicar que la expresión de este marcador no pueda afectar directamente al potencial de diferenciación de odontoblastos (no mostrado en video).
Diferentes condiciones de aislamiento hDPSCs podría traer capacidad de diferenciación diferente. Estas diferencias pueden deberse a la existencia de poblaciones diferentes en el tejido de la pulpa. Por lo tanto, la selección de los métodos de aislamiento might ser útil para la reparación de los tejidos objetivo específico y regeneración para futuros abordajes clínicos. Nuestros resultados indican la capacidad de mineralización superior de DPSC digerido enzimático en comparación con los superado. Sin embargo, estudios adicionales, tales como la evaluación de la formación de la estructura tubular in vivo y in vitro, se requieren para determinar cuál de estos dos procedimientos es aplicable para funcional dentina / terapias de regeneración de tejidos de celulosa.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Queremos agradecer a la Dra. Leila Shakeri y el Dr. Aref Dournaei para su discusión crítica y el Sr. Mohammad Reza Khadem Sharif por su apoyo técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | GIBCO | 11900-073 | |
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | C0130-100MG | |
| Dispase | GIBCO | 17105-041 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| Fetal Bovine serum defined (FBS) | HyClone | SH30070.03 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| L-glutamine | GIBCO | 25030-024 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| β-Glycerol phosphate disodium salt hydrate, BioUltra | Sigma | G9422-100G | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Osteogenesis Assay Kit | Millipore | PS01802031 | |
| Mouse IgG2b-PE isotype control | BD pharmingen | 50808088029 | |
| FITC mouse IgG2b isotype control | BD pharmingen | 559532 | |
| FITC mouse IgG1 κ isotype | BD pharmingen | 11471471 | |
| FITC/PE mouse anti-human CD34/CD45 | BD pharmingen | 341071 | |
| PE anti-human CD146 | BD pharmingen | 550315 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD90/FITC | Daka | 00034418 | |
| PE mouse anti-human CD73 | BD pharmingen | 550257 | |
| Anti-h CD105/Endoglin PE | BD pharmingen | FAB10971P | |
| PE mouse anti-human CD11b/Mac1 | BD pharmingen | 5553888 | |
| CD44 PE mouse anti human | BD pharmingen | 555479 | |
| Phosphate buffer Solution (PBS) | GIBCO | 003000 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 0.2 μm syringe filter | Millex-GV | SLGV033RB | |
| 25 cm2 culture flask | Sigma-Aldrich | Z707481 | |
| EQUIPMENT | |||
| BD FACSCalibur | BD | 342975 | |
| multiskan microplate spectrophotometer | Thermo scientific | 51119200 | |
| Fleurcense Microscope | Olympus | ||
| Flowing Software version 2.3.1 | |||
References
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