1. सीडीएनए अभिव्यक्ति क्लोन उठा सीडीएनए लाइब्रेरी एकल बैक्टीरिया ग्लिसरॉल शेयरों में एक 96-अच्छी तरह से प्रारूप में क्लोन के रूप में प्रदान की जाती है. पिकर मेनू में Norgen CP7200 Rearray कमांड का प्रयोग, स्रोत थाली और टीका लगाना से 1.5 मिलीग्राम / एक 96 deepwell (1 मिलीलीटर अच्छी तरह से) की थाली में लेग amp में बैक्टीरियल क्लोनों लेने. एक गैस पारगम्य सील साथ deepwell प्लेटें सील और 37 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में रातोंरात सेते हैं. 2. सीडीएनए अभिव्यक्ति लाइब्रेरी की तैयारी Deepwell 2,000 rpm पर 20 मिनट के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में थाली adapters का उपयोग बैक्टीरिया युक्त प्लेटें स्पिन. कुओं से मीडिया Aspirate, बैक्टीरियल गोली बरकरार जा. लैब स्वचालन वर्कस्टेशन के डेक कॉन्फ़िगर के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है. प्लाज्मिड तैयारी के लिए समाधान troughs 1-5 में वितरित कर रहे हैं और deepwell प्लेट डेक पर रखा गया है. क्षालन समाधान के साथ एक multiwell गर्तआसन्न deepwell थाली करने के लिए रखा है. युक्तियाँ टिप रैक में लोड कर रहे हैं. निर्वात कई गुना इकट्ठा. प्लाज्मिड बाध्यकारी प्लेट कई गुना के अंदर रखा गया है और प्लाज्मिड फिल्टर प्लेट कई गुना के शीर्ष पर रखा गया है. Pipetting और नीचे 250 μl समाधान 1 (Resuspension बफर) के साथ छर्रों Resuspend. 250 μl समाधान 2 (lysis बफर) के अलावा द्वारा बैक्टीरिया lyse. प्लेट और सील पूरा मिश्रण की अनुमति उलटा. 2 मिनट टाइमर शुरू. 350 μl 3 समाधान (Neutralisation बफर) जोड़ें. थाली सील और 3 बार पलटना. प्लाज्मिड फ़िल्टर प्लेटों को बैक्टीरियल lysates स्थानांतरण. 5 मिनट के लिए वैक्यूम लागू. फ़िल्टर थाली निकालें और कई गुना के शीर्ष पर बाध्यकारी प्लेट जगह है. 1 मिनट के लिए वैक्यूम लागू. अतिरिक्त (ऐडवर्ड्स) धोने बफर के 500 μl जोड़ें. 2 मिनट के लिए वैक्यूम लागू. धोने बफर 4 समाधान के 900 μl जोड़ें. 2 मिनट के लिए वैक्यूम लागू. दोहराएँ है2.14 tep. एक अतिरिक्त 15 मिनट के लिए वैक्यूम लागू. डीएनए कई गुना अंदर संग्रह प्लेट रखें. बाध्यकारी प्लेट क्षालन बफर के 100 μl जोड़ें और 2 मिनट के लिए सेते हैं. 10 मिनट के लिए वैक्यूम. संग्रह की थाली और उपाय डीएनए एकाग्रता को Nanodrop 8000 प्रयोग निकालें. आमतौर पर ~ की एक उपज 100 एनजी / μl इस विधि के साथ उम्मीद की जा सकती है. 3. सेल सीडिंग HEK293 कोशिकाओं और trypsinized गिना रहे हैं. 2 x 10 4 कोशिकाओं एक PerkinElmer ThermoFisher 96-अच्छी तरह multidrop का उपयोग Viewplate प्रत्येक कुएं में तिरस्कृत कर रहे हैं. कोशिकाओं 37 पर रातोंरात incubated हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. 4. अभिकर्मक 25 μl सीरम मुक्त मध्यम में प्रति अच्छी तरह से एक दौर 96 अच्छी तरह से थाली नीचे में 100 सीडीएनए एनजी के साथ 100 एनजी GFP-Grb2 प्लास्मिड डीएनए के एक मिश्रण तैयार करें. 25 μl सीरम मुक्त अच्छी तरह से प्रति 0.5 μl Transfectin वाले मीडिया जोड़ें. मिश्रण और टाइमर के लिए शुरूr 30 मिनट. एक सौम्य वितरण पद्धति का उपयोग करके कोशिकाओं सीडीएनए / Transfectin मिश्रण के 50 μl स्थानांतरण. वैकल्पिक रूप से, अभिकर्मक मिश्रण प्लेटों में 1 तिरस्कृत कर सकते हैं और फिर कोशिकाओं शीर्ष पर जोड़ा (रिवर्स अभिकर्मक). 37 पर रातोंरात कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. 5. छवि अधिग्रहण ओपेरा सॉफ्टवेयर शुरू करो. प्रयोग की स्थापना के एक स्क्रीन स्नैपशॉट चित्रा 3 में दिखाया गया है. "विन्यास" टैब का चयन करें और 20x उद्देश्य और सही थाली प्रकार का चयन करें. "कॉलर" उद्देश्य पर सही मूल्य सुनिश्चित करने के लिए सेट कर दिया जाता है लिए अलग थाली प्रकार के साथ ध्यान केंद्रित करने के लिए अनुमति देने के लिए. "माइक्रोस्कोप" टैब चुनें. FITC (488 लेजर) और 2 जोखिम के रूप में परिभाषित 1 जोखिम यूवी (365 लेजर). दोनों जोखिम पर यूवी फिल्टर सक्रिय और जोखिम 1 1 कैमरा और 2 कैमरा 2 जोखिम आवंटित. 800 मिसे 1 जोखिम और 2 प्रदर्शन के लिए 40 मिसे के लिए जोखिम बार सेट. "माइक्रोस्कोप" टैब चुनें. ई परिभाषित करें(488 लेजर) FITC और यूवी (365 लेजर) के रूप में 2 जोखिम के रूप में 1 xposure. दोनों जोखिम पर यूवी फिल्टर सक्रिय और जोखिम 1 1 कैमरा और 2 कैमरा 2 जोखिम आवंटित. 800 मिसे 1 जोखिम और 2 प्रदर्शन के लिए 40 मिसे के लिए जोखिम बार सेट. 1 जोखिम का चयन करें. सेट 0 सुक्ष्ममापी ऊंचाई ध्यान केंद्रित. "ध्यान" का चयन करें. एक बार ध्यान केंद्रित, 1 कैमरे का पर्दाफाश. ध्यान ऊंचाई को समायोजित करने के लिए जोखिम विमान अनुकूलन और "लो ऊंचाई पर क्लिक करें. जोखिम बार और लेजर शक्ति बदलें ~ 3000 की एक अधिकतम पिक्सेल तीव्रता दे. जोखिम मापदंडों को बचाओ. प्रदर्शन के लिए 2 दोहराएँ. "प्रयोग परिभाषा" टैब का चयन करें. लेआउट और sublayout बनाएँ. खींचें और प्रासंगिक लेआउट, जोखिम, संदर्भ छवि skewcrop फ़ाइल और sublayout ड्रॉप. प्रयोग सहेजें. "स्वचालित प्रयोग" टैब का चयन करें और छवियों को प्राप्त है. 6. छवि विश्लेषण (ImageJ 1.46h संस्करण पर आधारित है.) कन्वर्ट मालिकाना PerkinElmer फ्लेक्स फ़ाइलें. टैग्ड इमेज फार्मैट tif फ़ाइल का उपयोग करते हुएFlex2Volocity Acapella स्क्रिप्ट. एक छवि अनुक्रम के रूप में ImageJ में छवियाँ आयात करने के लिए, एक ढेर में जिसके परिणामस्वरूप. एक 2 चैनल hyperstack में छवि / Hyperstack / Hyperstack मेनू आइटम के लिए ढेर का चयन करके ढेर में परिवर्तित. स्लाइस के संख्या आयातित ढेर के आधे के लिए सेट किया जाना चाहिए. GFP छवि / डुप्लिकेट आदेश का उपयोग चैनल डुप्लिकेट: डुप्लिकेट hyperstack चेकबॉक्स टिक और चैनल निर्दिष्ट करें: 1-1. इसके बाद दोहराया ढेर का उपयोग करें. प्रक्रिया / 0.01% संतृप्त पिक्सल के साथ कंट्रास्ट बढ़ाने का चयन करें, ढेर हिस्टोग्राम का उपयोग और Image/Type/8-bit साथ 8 बिट के साथ परिवर्तित. एक 15 पिक्सेल त्रिज्या स्थानीय अनुकूली विपरीत (1 पैरामीटर) सीमा q = 30 साथ Bernsen एल्गोरिथ्म का उपयोग कर विभाजन परिभाषित करें. काले रंग की पृष्ठभूमि चेकबॉक्स पर छवि समायोजित / ऑटो / स्थानिय थ्रेसहोल्ड मेनू में व्हाइट वस्तुओं टिक. विभाजन गुणवत्ता नियंत्रण: मूल छवियों पर खंडों वस्तु समोच्च उपरिशायी उत्पन्न करते हैं. Featuकणों का विश्लेषण करके निकासी: मापने क्षेत्र का मतलब है, और प्रत्येक organelle की कुल तीव्रता. परिणाम फ़ाइलें सहेजें. आर में सुविधाओं परिणाम फ़ाइल खोलें और एक हिस्टोग्राम उत्पन्न. 7. प्रतिनिधि परिणाम सामान्य परिस्थितियों के अंतर्गत Grb2 पूरे सेल भर स्थानीयकृत है. एक वृद्धि कारक रिसेप्टर की उत्तेजना होने पर यह प्लाज्मा झिल्ली translocates है और बाद में endosomes में भली भाँति के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है. बाध्यकारी Grb2 में सक्षम एक कोशिका की सतह रिसेप्टर की अभिव्यक्ति इस स्थानान्तरण के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है. एक ठेठ स्क्रीनिंग प्रयोग में, GFP-Grb2 स्थानीयकरण में कोई परिवर्तन नहीं मनाया जाता है. हालांकि, जब एक प्रोटीन व्यक्त की है कि एक उप सेलुलर साइट रंगरूटों Grb2, वहाँ स्थानीयकरण में एक परिवर्तन है कि आसानी से कल्पना प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के द्वारा किया जा सकता है. Endosome संरचनाओं की तरह GFP-Grb2 के relocalization में EGFR परिणामों की अभिव्यक्ति है, उदाहरण के लिए (चित्रा) 4. इस प्रकार, जब एक जीनोम चौड़ा पुस्तकालय आवेदन, यह उम्मीद की जा Grb2 बाध्यकारी है कि उपन्यास कोशिका की सतह प्रोटीन की पहचान की जा सकती है. इस विधि कोशिका की सतह प्रोटीन का पता लगाने के लिए सीमित नहीं है. उदाहरण के लिए, Dynamin2 उप सेलुलर GFP-Grb2 endosome की तरह भर्ती (5 चित्रा) प्रदर्शित करने के स्थानीयकरण में परिवर्तन लाती है. सी टर्मिनल Grb2 SH3 डोमेन के लिए Dynamin2 बांध और इस जटिल 9,10 के endocytosis में शामिल है. इस प्रकार, इस दृष्टिकोण सामान्य प्रोटीन बाध्यकारी परिसरों की पहचान के लिए सक्षम बनाता है और SH2 डोमेन के लिए बातचीत भागीदारों की पहचान करने के लिए सीमित नहीं है. स्थानान्तरण के कई अलग अलग प्रकार के लिए endosomes जैसे प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण के रूप में उम्मीद की जा सकती है, अन्य cytoplasmic vesicular संरचना या नाभिक. इसलिए, यह सिफारिश की है कि सभी छवियों को भी आंखों से निरीक्षण कर रहे हैं. हालांकि, जब बड़े सेट स्क्रीनिंग एक स्वचालित cDNAsछवि विश्लेषण एल्गोरिथ्म अधिक व्यावहारिक है. इस मामले में, एल्गोरिदम का एक संयोजन वांछनीय हाजिर करने के लिए endosomes, cytoplasm / नाभिक का पता लगाने की पहचान करने के लिए परमाणु चक्कर और सामान्य morphological एल्गोरिदम की पहचान करने के लिए सेलुलर आकार में परिवर्तन की पहचान का पता लगाने के रूप में है, जैसे. इन विभिन्न प्ररूपी तरीकों का पता लगाने का उपयोग 11 कहीं अधिक विस्तार से चर्चा की गई है. चित्रा 1 प्रयोग की समग्र योजना. प्रयोग पूरी तरह से उच्च सामग्री स्क्रीनिंग कार्यप्रवाह प्रवर्धन और सीडीएनए लाइब्रेरी की तैयारी सीडीएनए वैक्टर प्लस संवाददाता constructs, छवि अधिग्रहण और छवि विश्लेषण का उपयोग कर मुक्त खुला सॉफ्टवेयर IMAGEJ अभिकर्मक के साथ शुरू विवरण. एफigure 2 Tecan डेक का विन्यास. (1) बाईं ओर, पांच 100 मिलीलीटर troughs 1 buffers (40 मिलीग्राम), 2 (40 मिलीग्राम), 3 (50 मिलीग्राम), (60 मिलीग्राम) ऐडवर्ड्स और A4 (100 मिलीलीटर) के साथ भरा जाना चाहिए. गर्त A4 प्रक्रिया के दौरान एक बार फिर से भरा आवश्यकता होगी. (2) निर्वात कई गुना इस उदाहरण में 14 स्थान पर स्थित है. (3) जीवाणु छर्रों के के साथ deepwell प्लेट 30 स्थिति, क्षालन बफर गर्त में 25 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ बगल में स्थित है. (4) 8-चैनल सिर के लिए डिस्पोजेबल युक्तियाँ बाईं ओर और सुझावों पर टिप रैक के में multichannel सिर के लिए लोड किया जा की जरूरत के लिए 40 स्थान पर भरा जाना चाहिए. Tecan FreedomEvo तरल हैंडलर है कि इस प्रयोग में प्रयोग किया जाता है 500 μl सीरिंज के साथ सुसज्जित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा3. ओपेरा LX पर छवि अधिग्रहण स्वचालन. ए) विन्यास टैब (1) का चयन करें. लेजर प्रयोग (2) के लिए आवश्यक लाइनों को सक्रिय करें. छवि अधिग्रहण (3) के लिए कैमरों का चयन करें. प्लेट और प्रयोग (4) के लिए उद्देश्य लेंस प्रकार का चयन करें. बी) खुर्दबीन टैब (1) का चयन करें. प्रकाश स्रोत और जोखिम 1 (2,3) के लिए जोखिम समय को परिभाषित करें. अच्छी तरह से एक पर ध्यान दें और ऊंचाई (4) ले लो. सी) प्रयोग परिभाषा टैब (1) का चयन करें. खींचें और ड्रॉप जोखिम, skewcrop, संदर्भ, लेआउट, और sublayout फ़ाइलें (2). खींचें और ड्रॉप प्रयोग फ़ाइल (3). डी) स्वचालित प्रयोग (1) का चयन करें. खींचें और ड्रॉप प्रयोग फ़ाइल (2). उपयुक्त बारकोड (3) का आवंटन. प्रारंभ बटन (4) पर क्लिक करके छवि अधिग्रहण शुरू बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . <stro> 4 चित्रा एनजी सीडीएनए अभिव्यक्ति द्वारा स्थानान्तरण GFP-Grb2. एक transmembrane वृद्धि कारक रिसेप्टर की overexpression पर एक प्रमुख cytoplasmic endosome संरचनाओं की तरह स्थानीयकरण से GFP Grb2 स्थानांतरित और बाद में endosomes के लिए internalizes. बाएँ पर, COS M6 कोशिकाओं के माइक्रोस्कोपी छवियों दिखाए जाते हैं कि transiently (ऊपर) GFP-Grb2 या GFP-Grb2 प्लस EGFR (नीचे) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे. Endosome संरचनाओं की तरह GFP-Grb2 के स्थानांतरण में EGFR परिणामों के सह अभिव्यक्ति. चित्रा 5. सीडीएनए प्रेरित GFP-Grb2 के स्थानान्तरण के उदाहरण. GTPase Dynamin2, जो endocytosis Grb2 की मध्यस्थता में शामिल है endosome संरचनाओं की तरह (परिक्रमा) GFP-Grb2 relocates. इस प्रयोग में, GFP-Grb2 किया गया था DNM2 HEK293T कोशिकाओं में साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट. कोशिकाओं Hoechst 33342 के साथ दाग थे 24 घंटे के बाद और छवियों Ope पर हासिल किया गयाra LX. ग्रीन चैनल (GFP) के दृश्य का एक क्षेत्र और पराबैंगनी (नीला, Hoechst 33342) प्रदर्शित होता है.