تفاصيل المقال بروتوكول لمواقع محددة ترنسفكأيشن من مخلوط تسلسل سيرنا في ثقافة خلايا الثدييات تمسكا باستخدام مجموعة ومسرى مكروي (MEA).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عالية الكفاءة، ومواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا تمسكا مع سيرنا باستخدام صفائف مسرى مكروي (MEA)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
حققت اكتشاف المسار رني في حقيقيات النوى والتطور اللاحق للعملاء رني، مثل سيرنا وshRNA، وهي طريقة فعالة جدا لإسكات جينات معينة 1-8 لعلم الجينوم الوظيفي والعلاج. ومن التحديات الرئيسية المشاركة في الدراسات القائمة على رني هو تسليم من وكلاء رني إلى الخلايا المستهدفة. التقنيات التقليدية التسليم غير الفيروسية، مثل الصعق الكهربائي ومعظم أساليب ترنسفكأيشن الكيميائية غالبا ما تفتقر إلى المراقبة الضرورية المكانية على التسليم وتحمل الكفاءة ترنسفكأيشن الفقراء 9-12. وقد أدت التطورات الحديثة في طرائق نقل المواد الكيميائية مثل الدهون الموجبة، والبوليمرات الموجبة والجسيمات النانوية في تعزيز الكفاءة ترنسفكأيشن غاية 13. ومع ذلك، هذه التقنيات لا تزال دون توفر السيطرة المكانية دقيقة على التسليم التي يمكن أن المنمنمة الفئات استفادة هائلة التكنولوجيات الفائقة الإنتاجية والدراسات خلية واحدة من خلايا والتحقيق خلايا التفاعلات. NT "مكنت> التطورات التكنولوجية الحديثة في إيصال الجينات عالية الإنتاجية ترنسفكأيشن من الخلايا الملتصقة 14-23، أغلبية التي تستخدم الصعق الكهربائي الميكروسكيل. الصعق الكهربائي و يقدم الميكروسكيل دقيقة المكانية والزمانية السيطرة على تسليم (إلى الخلايا واحدة) وتبين أنه لتحقيق الكفاءة العالية 19، 24-26. بالإضافة إلى ذلك، النهج القائم الصعق الكهربائي و لا تحتاج إلى فترة طويلة من الحضانة (عادة 4 ساعات) مع المجمعات سيرنا وDNA عند الضرورة في الطرق الكيميائية ومقرها ترنسفكأيشن يؤدي إلى الدخول المباشر من سيرنا عارية وDNA لا يمكن أن يتحقق في جزيئات الخلية السيتوبلازم. ونتيجة لذلك التعبير الجيني في وقت مبكر من ست ساعات بعد ترنسفكأيشن 27. مختبرنا أظهرت في السابق استخدام صفائف مسرى مكروي (MEA) لمواقع محددة في ترنسفكأيشن تمسكا الثقافات خلايا الثدييات 17-19. في النهج القائم MEA، ويتحقق تسليم حمولة الوراثية عبر electroporati الصغيرة النطاق المترجمةعلى من الخلايا. تطبيق من نبض الكهربائية لأقطاب مختارة يولد المجال الكهربائي المحلي الذي يؤدي إلى الصعق الكهربائي من الخلايا الموجودة في المنطقة من الأقطاب الإلكترونية المبرمجة. مراقبة مستقلة من الأقطاب الكهربائية الدقيقة يوفر السيطرة المكانية والزمانية على ترنسفكأيشن وتمكن أيضا تجارب متعددة ترنسفكأيشن القائمة التي سيتم تنفيذها على نفس الثقافة زيادة الإنتاجية والحد من ثقافة التجريبية إلى ثقافة التنوع.
نحن هنا وصف الإعداد التجريبية وبروتوكول لترنسفكأيشن من استهداف خلايا هيلا ملتصقة مع سيرنا الموسومة fluorescently تسلسل باستخدام الصعق الكهربائي و مخلوط. ويمكن أيضا نفس البروتوكول استخدامها لترنسفكأيشن من ناقلات البلازميد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبروتوكول الموصوفة هنا مدد بسهولة إلى مجموعة متنوعة من خطوط خلايا الثدييات مع تعديلات طفيفة. توافر التجارية الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع كل من القطب أنماط محددة مسبقا والعرف جعل هذا الأسلوب للوصول رس مختبرات معظم البحوث الأساسية مع خلية المعدات الثقافة.
البروتوكول
1. MEA إعداد
- يمكن إما للاستخدام في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف التجارب الصعق الكهربائي و تكون ملفقة باستخدام معيار تقنية ضوئيه كما هو موضح سابقا 18 أو شراؤها مباشرة من البائعين من الشركات المصنعة مثل أنظمة MEA قناة موضوع (http:/www.multichannelsystems.com/) وألفا MED العلمية المحدودة، ( http://www.MED64.com) . ملفقة والاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في التجارب لدينا في المنزل في منشأة غرفة نظيف....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه المقالة نحن الفيديو شرح استخدام MEA لمواقع محددة من خلايا هيلا ترنسفكأيشن مع سيرنا مخلوط تسلسل. واحدة من مزايا هذه التكنولوجيا هو انطباقها على خطوط مختلفة من الخلايا بما في ذلك خطوط الخلايا الأولية. وقد أظهرت مختبرنا سابقا استخدام هذه التكنولوجيا لمواقع محددة ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية قرن آمون الثقافة الأولية من الفئران اليوم E18 القديمة وNIH-3T3 الخلايا مع تسلسل سيرنا مخلوط وGFP البلازميد 18 و 19. لقد كان لدينا أيضا النجاح في تقديم سيرنا ضد هدف وظيفي في خلاي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
المواد
| اسم كاشف | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
| خلية الإعلام: المتقدمة MEM الجلوتامين L-200 ملي مول البنسلين / الستربتوميسين المصل البقري الجنين | Gibco / إينفيتروجن Himedia المختبرات / VWR Lonza المجموعة المحدودة Gibco / إينفيتروجن | 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 | خلية الإعلام التركيب: 2٪ FBS، Pennstrep 2٪ الجلوتامين L-و 2٪ في المقدمة MEM |
| التربسين EDTA | Mediatech، وشركة | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech، وشركة | 21-040-CV | |
| سارعت الكسا 488 و رودامين الموسومة sequسينعقد سيرنا | QIAGEN، وشركة | 1027292 | |
| الصعق الكهربائي العازلة | Biorad المختبرات | 165-2677 | |
| مولد الموجي | واقعي | 2414A | ويمكن استخدام أي الموجي / مولد النبض التي يمكن أن توفر النبضات المطلوب. |
المراجع
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
