Alta efficienza, sito-specifica trasfezione di cellule aderenti con siRNA mediante matrici microelettrodi (MEA)

Sommario

L'articolo descrive il protocollo per sito-specifica di transfezione criptato sequenza di siRNA in una coltura cellulare di mammifero aderente utilizzando una matrice di microelettrodi (MEA).

Abstract

La scoperta della via di RNAi in eucarioti e il conseguente sviluppo di agenti RNAi, come siRNA e shRNA, hanno raggiunto un metodo efficace per mettere a tacere i geni specifici ^1-8 per la genomica funzionale e terapie. Una sfida importante coinvolto in studi basati su RNAi è la consegna di agenti RNAi alle cellule bersaglio. Tradizionali non virali tecniche di parto, come l'elettroporazione di massa e metodi di trasfezione chimici spesso non hanno il controllo spaziale necessaria su consegna e permettere l'efficienza di trasfezione poveri ^9-12. I recenti progressi nei metodi di trasfezione chimici come lipidi cationici, polimeri cationici e nanoparticelle hanno portato ad efficienze di trasfezione altamente avanzate ^13. Tuttavia, queste tecniche ancora non riescono a offrire un controllo preciso dello spazio sulla consegna che possono beneficiare immensamente miniaturizzata tecnologie high-throughput, studi cella singola e le indagini di interazioni cellula-cellula. nt "> I recenti progressi tecnologici nella consegna del gene hanno permesso alta produttività trasfezione di cellule aderenti ^14-23, la maggioranza dei quali utilizzano elettroporazione microscala. elettroporazione Microscale offre spazio-temporale preciso controllo di consegna (fino a singole cellule) ed è stato dimostrato per ottenere alte efficienze ^{19, 24-26.} Inoltre, approcci basati elettroporazione non richiedono un lungo periodo di incubazione (tipicamente 4 ore) con complessi siRNA e DNA come necessario in metodi di trasfezione base chimica e causare l'immissione diretta di siRNA nudo e DNA molecole nel citoplasma cellulare. Di conseguenza espressione genica può essere ottenuto fino a sei ore dopo la trasfezione ^27. nostro laboratorio ha precedentemente dimostrato l'utilizzo di matrici di microelettrodi (MEA) per sito-specifica trasfezione aderenti in colture cellulari di mammifero ^17-19. Nell'approccio basato MEA, la consegna del carico utile genetica avviene tramite localizzato micro-scala electroporatisu di cellule. Una applicazione di impulsi elettrici agli elettrodi selezionati genera locale campo elettrico che conduce alla elettroporazione di cellule presenti nella regione degli elettrodi stimolati. Il controllo indipendente delle micro-elettrodi fornisce controllo spaziale e temporale sopra trasfezione e permette anche esperimenti di trasfezione multipli basati da eseguire sulla stessa cultura aumentando la produttività e riducendo sperimentale cultura a cultura variabilità.

Qui si descrive l'apparato sperimentale e il protocollo per la trasfezione mirata di aderenti cellule HeLa con una fluorescente tag criptato siRNA sequenza usando elettroporazione. Lo stesso protocollo può essere utilizzato anche per la trasfezione di vettori plasmidici. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere facilmente estesa ad una varietà di linee cellulari di mammifero con modifiche secondarie. Disponibilità commerciale degli accordi ambientali multilaterali con i modelli di elettrodi sia predefiniti e personalizzati rendono questa t accessibile tecnicala maggior parte dei laboratori di ricerca o con attrezzature di base di coltura cellulare.

Protocollo

1. MEA Preparazione

1. MEA per l'uso negli esperimenti di elettroporazione possono essere fabbricati usando la tecnica standard di fotolitografia come descritto in precedenza ¹⁸ o acquistati direttamente da fornitori di produttori MEA come i sistemi multicanale (http:/www.multichannelsystems.com/) e Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . Le MEA utilizzati nei nostri esperimenti sono stati realizzati in-house presso l'impianto camera pulita in Arizona State University, che è gestito dal Centro per la Ricerca Elet....

Discussione

In questo articolo il video che dimostrano l'uso di MEA per il sito-specifica trasfezione di cellule HeLa con strapazzate sequenza di siRNA. Uno dei vantaggi di questa tecnologia è la sua applicabilità a diverse linee cellulari incluse linee cellulari primarie. Il nostro laboratorio ha già dimostrato l'uso di questa tecnologia per il sito-specifica trasfezione di colture primarie neuronali dell'ippocampo di ratto E18 dal giorno di vita e NIH-3T3 strapazzate con sequenze siRNA e GFP plasmide ^{18, 19.}

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Cellulari media: Avanzata MEM L-Glutammina 200 mM Penicillina / streptomicina Siero fetale bovino	Gibco / Invitrogen Himedia Laboratori / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Composizione cella media: 2% FBS, Pennstrep 2% L-glutammina e il 2% in Advance MEM
Tripsina EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 e rodamina tagged strapazzate sequrienza siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Elettroporazione tampone	Biorad Laboratories	165-2677
Generatore di forme d'onda	Pragmatico	2414A	Qualsiasi forma d'onda / generatore di impulsi che può fornire gli impulsi desiderati possono essere utilizzati.