Fibroblasts Associated הסרטן (cafs) להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות, אנגיוגנזה, ודלקת. כאן אנו מתארים שיטה לבודדה אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הנורמלי מעכבר רענן ורקמות אדם על ידי מיון תא, באמצעות PDGFRα כסמן פני שטח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)
במאמר זה
סיכום
תקציר
fibroblasts סרטן הקשורים (cafs) הוא סוג התא הבולט ביותר בתוך stroma הגידול של סוגי סרטן רבים, בסרטן השד בפרט, והנוכחות הבולטת שלהם קשורה לעתים קרובות עם 1,2 פרוגנוזה גרוע. Cafs הוא subpopulation הופעל של fibroblasts סטרומה, שרבים מהם להביע את סמן myofibroblast α-SMA ל 3. Cafs מקורן fibroblasts רקמות המקומיים, כמו גם מתאי מוח עצם שהופקו גויסו לגידול לפתח ולאמץ פנוטיפ CAF תחת השפעת גידול microenvironment 4. Cafs הוצג כדי להקל ייזום, צמיחה והתקדמות גידול באמצעות איתות שמקדמת התפשטות גידול תא, אנגיוגנזה, ופלישת 5-8. אנחנו הוכחנו כי cafs לשפר את צמיחת גידול על ידי תיווך דלקת גידול מקדם, החל בשלבים המוקדמים מראש neoplastic 9. למרות ראיות גוברות של cafs לשחק תפקיד המפתח בקידום צמיחת גידול,Cafs לומד כבר אתגר מתמשך בשל חוסר הסמנים CAF ספציפיים וההטרוגניות העצומה של תאים אלה, עם תת רבים שיתוף קיים בגידול microenvironment 10. יתר על כן, לומד fibroblasts במבחנה מתעכבת עקב העובדה שפרופיל ביטוי הגנים שלהם לעתים קרובות שינה בתרבית הרקמה 11,12. כדי לטפל בבעיה זו ולאפשר ביטוי פרופיל גנטי משוחד של fibroblasts מעכבר רענן ורקמות אדם, פתח שיטה המבוססת על פרוטוקולים קודמים למיון תא Fluorescence-Activated (FACS) 13,14. הגישה שלנו מסתמכת על ניצול PDGFRα כסמן משטח לבודד מעכבר fibroblasts טרי ורקמה אנושית. PDGFRα מתבטא בשפע על ידי שני fibroblasts וcafs 9,15 הנורמלים. שיטה זו מאפשרת בידוד של אוכלוסיות טהורות של fibroblasts וcafs הרגיל, כולל, אך לא מוגבלת ל- SMA α + הופעל myofibroblasts. fibroblasts מבודד אז יכול להיותהמשמש לאפיון והשוואה של האבולוציה של ביטוי גנים המתרחשת בcafs במהלך tumorigenesis. ואכן, אנו ואחרים דיווחו על פרופיל ביטוי של fibroblasts בודד על ידי תא מיון 16. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ופרופיל אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts מרקמות עור שד, סרטן לבלב וסרטן ריאות. יתר על כן, השיטה שלנו מאפשרת גם culturing של תאים ממוינים, על מנת לבצע ניסויים פונקציונליים וכדי למנוע זיהום על ידי תאים סרטניים, אשר לעתים קרובות מכשול גדול כאשר מנסה cafs התרבות.
פרוטוקול
1. ביתור רקמת שד או עור מעכברים
- לפני ביתור הרקמה הרצויה מעכברים, להכין את הציוד וריאגנטים הבאים:
ספקים:
- כלי ניתוח (שטף עם חומר ניקוי ולאחר מכן טבל באתנול 70%).
- משטח הקלקר לנוח על העכבר במהלך נתיחה.
- סיכות או מחטים להחזיק עכברים במהלך נתיחה.
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שימוש PDGFRα כסמן לתוצאות פיברובלסטים בבידוד של אוכלוסיות מועשרות ברמה גבוהה של fibroblasts רקמות. רמת הטוהר לאחר המיון הייתה 99%, כלכמת את הניתוח שלאחר המיון (איור 2 א). הערכת אחוז תאים שאינם מזהם פיברובלסטים על ידי הביטוי היחסי של גני בקרת תא ספציפיים (האיור 2B) בדרך כלל מראה זיהום 0.1-0.6%. רמה זו של טוהר מאפשרת יצירת פרופילי transcriptome איכות גבוהה של fibroblasts המבודד 9.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בעוד הניסויים שבוצעו בתרביות רקמה יכולים להיות אינפורמטיבי ולהציע עקרונות פונקציונליים כי ניתן מאומת in vivo, ידוע ששינויים גדולים מתרחשים בביטוי גן בתאים בתרבית 11,12. על מנת להימנע מצעד תרבית רקמה כאשר אפיון ביטוי גנים בfibroblasts, פתחו פרוטוקול המאפשר בידוד של כמו גם פיברובלסטים נורמלים, סרטן הקשורים מעכבר טרי או רקמה אנושית. פרוטוקול זה מיושם בהצלחה ברקמות עור, לבלב ושד מעכבר ואדם מ9. בידוד של fibroblasts באמצעות מיון FACS דורש סמן משטח שfibrobl.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
תודות
אנו מודים לד"ר יצחק וOschry ד"ר אורית שגיאה, אסיף על עזרו במיון FACS. מחקר זה נתמך על ידי מענקים לNE מהתכנית השביעית של האיחוד האירופית Framework (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק n ° [276890], מהמלחמה בסרטן האגוד (# 20110078), ומישראל לחקר הסרטן בקרן (המחקר פרס פיתוח קריירה).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם המגיב חברה מספר קטלוג תגובות (אופציונלי) | |||
| DMEM | Gibco | 41965 | |
| PBS | תעשיות ביולוגיות | 02-023-1A | |
| Collagenase השני | ורטינגטון | LS4176 | |
| Collagenase IV | ורטינגטון | LS4188 | |
| Deoxyribonuclease | ורטינגטון | LS2007 | |
| PharmLyse | BD | 555899 | |
| מסננת תא 70 מיקרומטר | SPL | 93070 | |
| המטוהר אנטי עכבר CD16/CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
| ויה חללית (7AAD) | דואר Bioscience | 00-6993-50 | |
| אנטי עכבר CD140a-PE (PDGFRa) | דואר Bioscience | 12-1401-81 | |
| אנטי עכבר F4/80- FITC | Cederlane | CL8940F | |
| DMEM w / o אדומה פנול | Gibco | 31053 | |
| סוג קולגן אני | BD Biosciences | 354236 |
מקורות
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Seminars in cell & developmental biology.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
