Kvantitativ FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Analyse for SENP1 Protease Kinetics Bestemmelse
Summary
En hidtil ukendt fremgangsmåde indebærer kvantitativ analyse af FRET (Förster Resonance Energy Transfer) signaler beskrives til undersøgelse af enzymkinetik.<em> K<sub> M</sub</em> Og<em> K<sub> Kat</sub</em> Opnåedes til hydrolyse af det katalytiske domæne af SENP1 (SUMO / Sentrin specifik protease 1) til præ-SUMO1 (Small ubiquitin-lignende modifier). De generelle principper i denne kvantitative-FRET-baserede protease kinetisk undersøgelse kan anvendes på andre proteaser.
Abstract
Reversible posttranslationelle modifikationer af proteiner med ubiquitin eller ubiquitin-lignende proteiner (Ubls) er almindeligt anvendt til dynamisk at regulere protein aktivitet og har forskellige roller i mange biologiske processer. For eksempel kovalent SUMO ændrer mange eller proteiner med vigtige roller i mange cellulære processer, herunder celle-cyklus regulering, celleoverlevelse og død, DNA beskadigelse respons og stressrespons 1-5. SENP, som SUMO-specifik protease, til funktioner som en endopeptidase i modningen af SUMO forstadier eller som en isopeptidase fjerne SUMO fra sine målproteiner og opfriske SUMOylation cyklus 1,3,6,7.
Den katalytiske effektivitet eller specificitet af et enzym er bedst karakteriseret ved forholdet mellem de kinetiske konstanter, kcat / KM. I flere studier har de kinetiske parametre for SUMO-SENP par blevet bestemt ved forskellige fremgangsmåder, herunder polyacrylamid-gel-baseret Western-blot, radIOActive-mærket substrat, fluorescerende forbindelse eller protein mærket substrat 8-13. Men de polyacrylamid-gel-baserede teknikker, der benyttede "indfødte" proteiner, men er arbejdskrævende og teknisk krævende, og som ikke umiddelbart egner sig til detaljeret kvantitativ analyse. Det opnåede kcat / KM fra studier med anvendelse af tetrapeptider eller proteiner med en ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) eller AMC (7-amino-4-methylcoumarin) fluorophor var enten op til to størrelsesordener lavere end de naturlige substrater eller kan ikke klart skelne mellem de iso-og endopeptidase aktiviteter SENPs.
For nylig FRET-baserede protease assays blev anvendt til at undersøge de afubiquitinerende enzymer (DUBs) eller SENPs med FRET-par af cyan fluorescerende protein (CFP), og gult fluorescerende protein (YFP) 9,10,14,15. Forholdet mellem acceptor emission til donor-emissionen blev anvendt som den kvantitative parameter for FRET signal monitor for protease activitet beslutsomhed. Men denne metode ignorerede signal krydskontaminationer på acceptor og donor emissionsbølgelængder ved acceptor og donor selv-fluorescens og derfor var ikke korrekte.
Vi udviklede en ny meget følsom og kvantitativ FRET-baseret proteaseassay til bestemmelse af de kinetiske parametre af præ-SUMO1 modning af SENP1. En manipuleret FRET-par CyPet og YPet med væsentlig forbedret FRET effektivitet og fluorescens kvantumudbytte, blev anvendt til at generere CyPet-(præ-SUMO1)-YPet substrat 16. Vi differentieret og kvantificeret absolutte fluorescenssignaler bidraget af donor og acceptor og FRET på acceptor-og emissionsbølgelængder, henholdsvis. Værdien af k cat / K M blev opnået som (3,2 ± 0,55) x 10 7 M-1s-1 for SENP1 mod præ-SUMO1, hvilket er i overensstemmelse med almindelige enzymatiske kinetiske parametre. Derfor er denne metode er gyldigt og kan anvendes etsa generel tilgang til at karakterisere andre proteaser så godt.
Protocol
Discussion
FRET teknologi er blevet anvendt til at undersøge pre-SUMO1 modning af SENP1 9. CFP-YFP blev anvendt som FRET-par og ratiometrisk analyse, som er forholdet mellem acceptoren i donor-emission, blev anvendt til at karakterisere de kinetiske egenskaber. Imidlertid er der ingen behandling af donor og acceptor selv-fluorescens i den traditionelle ratiometrisk FRET-analyse. Forholdet ikke direkte korrelerer med mængden af spaltet substrat.
Her rapporterer vi en udviklet meget f?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er meget taknemmelige for Victor GJ Rodgers for værdifuld rådgivning. Vi takker alle medlemmerne af Liao-koncernen til et meget tæt samarbejde arbejde og for at få hjælp med denne undersøgelse. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (Grant AI076504 til JL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
