الكمية الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) تحليل لتحديد حركية SENP1 البروتياز
Summary
يوصف أسلوب الرواية التي تنطوي على التحليل الكمي من الحنق (فورستر نقل الطاقة الرنين) إشارات لدراسة حركية الانزيم.<em> K<sub> M</sub</em> و<em> ك<sub> القط</sub</emتم الحصول على> لفي المجال المائي الحفاز SENP1 (سومو / Sentrin البروتيني محددة 1) إلى ما قبل SUMO1 (صغير اليوبيكويتين مثل التعديل). ويمكن تطبيق المبادئ العامة لهذه الدراسة البروتيني الحركية الكمية-الحنق القائم على البروتياز الأخرى.
Abstract
وتستخدم على نطاق واسع تعديلات ما بعد النقل عكسها من البروتينات مع البروتينات مثل اليوبيكويتين أو اليوبيكويتين-(Ubls) لتنظيم نشاط حيوي البروتين وأدوار متنوعة في العديد من العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، SUMO يعدل تساهميا عدد كبير أو البروتينات مع أدوارا هامة في العديد من العمليات الخلوية، بما في ذلك الخلايا دورة التنظيم وبقاء الخلية والوفاة، استجابة DNA الأضرار، والإجهاد استجابة 1-5. SENP، وSUMO محددة البروتيني، تكون بمثابة ببتيداز داخلية في نضوج السلائف SUMO أو باعتبارها isopeptidase لإزالة SUMO من البروتينات هدفه وتحديث دورة SUMOylation 1،3،6،7.
ويتميز كفاءة الحفاز أفضل أو خصوصية انزيم من نسبة الثوابت الحركية، ك القط / M K. في العديد من الدراسات، وقد تم تحديد المعلمات الحركية للSUMO-SENP أزواج بطرق مختلفة، بما في ذلك على أساس هلام بولكرلميد الغربي صمة عار، رادioactive التي تحمل علامات المسمى الركيزة، مجمع الفلورسنت أو البروتين الركيزة 8-13. ومع ذلك، فإن تقنيات بولكرلميد هلام القائم، والتي تستخدم في "الأم" هي بروتينات ولكن شاقة وتطالب من الناحية الفنية، التي لا تخضع بسهولة لأنفسهم التحليل الكمي مفصلة. وحصلت ك القط / M K من الدراسات التي تستخدم tetrapeptides أو البروتينات مع ACC (7-الأمينية-4-carbamoylmetylcoumarin) أو AMC (7-الأمينية-4-methylcoumarin) fluorophore إما يصل الى اثنين من أوامر من حجم أقل من ركائز الطبيعية أو لا يمكن التمييز بوضوح على شهادة الأيزو والأنشطة ببتيداز داخلية من SENPs.
واستخدمت مؤخرا فحوصات البروتيني، الحنق القائم على دراسة الأنزيمات deubiquitinating (يصف) أو SENPs مع الزوج الحنق من بروتين فلوري سماوي (CFP) وبروتين فلوري الصفراء (YFP) 9،10،14،15. تم استخدام نسبة الانبعاثات إلى الانبعاثات متقبل المانحة كمعلمة الكمية لرصد الحنق إشارة لميلان البروتينيtivity المصير. ومع ذلك، تجاهل هذا الأسلوب إشارة عبر التلوث ومتقبل في موجات من الانبعاثات المانحة ومتقبل المانحة الذاتي مضان وبالتالي لم يكن دقيقا.
وضعنا رواية شديدة الحساسية والكمية الفحص البروتيني الحنق القائم لتحديد معالم الحركية في مرحلة ما قبل النضج SUMO1 من SENP1. وهندسيا الحنق CyPet الزوج وYPet بكفاءة الحنق تحسنت بشكل ملحوظ ومضان العائد الكم، واستخدمت لتوليد CyPet-(قبل SUMO1)-YPet الركيزة 16. نحن متباينة وكميا إشارات مضان المطلقة ساهمت من قبل الجهة المانحة ومتقبل والحنق على موجات متقبل والانبعاثات على التوالي. تم الحصول على قيمة القط ك / M K ك (3.2 ± 0.55) X10 7 M -1 ق -1 من SENP1 نحو SUMO1 المسبق، وهو ما يتفق مع المعايير العامة الحركية الأنزيمية. لذلك، هذه المنهجية صالحة ويمكن استخدامSA النهج العام لتوصيف البروتياز الأخرى كذلك.
Protocol
Discussion
تم استخدام التكنولوجيا الحنق لدراسة ما قبل النضج SUMO1 من قبل SENP1 9. وقد استخدم CFP-YFP حيث يتحرك هذا الزوج الحنق وتحليل ratiometric، والتي هي نسبة انبعاثات متقبل لالمانحة، تم استخدامه لوصف خصائص الحركية. ومع ذلك، لا يوجد أي النظر في الجهات المانحة ومتقبل الذاتي مضان في ratiom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون جدا لفيكتور GJ رودجرز للمشورة قيمة. نشكر جميع أعضاء الفريق لياو للعمل التعاوني وثيقة للغاية وللمساعدة في هذه الدراسة. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنح AI076504 لJL).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| PCR II TOPO Kit | Invitrogen | K466040 |
| 2xYT | Research Products Internationa.l Corp. | X15600 |
| Ni-NTA Agrose | Thermo Scientific | 88222 |
| Coomassie plus (Bradford) Assay Regent | Thermo Scientific | 23238 |
| 384-well plate (glass bottom) | Greiner | 781892 |
| FlexStation II 384 plate reader | Molecular Device |
References
- Johnson, E. S. Protein modification By SUMO. Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).
- Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).
- Hay, R. T. SUMO: a history of modification. Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).
- Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. SUMO, ubiquitin’s mysterious cousin. Nature. , 202-210 (2001).
- Hochstrasser, M. SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein. Cell. , 5-8 (2001).
- Drag, M., Salvesen, G. S. DeSUMOylating enzymes-SENPs. IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).
- Mukhopadhyay, D., Dasso, M. Modification in reverse: the SUMO proteases. Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).
- Reverter, D., Lima, C. D. Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).
- Shen, L., et al. SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond. Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).
- Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).
- Mikolajczyk, J., et al. Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs. Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).
- Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes. Biochem. J. , 335-344 (2010).
- Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family. Biochemical Journal. 409, 461 (2008).
- Engels, I. H., et al. A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity. Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).
- Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing. Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).
- Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).
