En Molekylær Udlæsning af Langsigtet olfaktorisk Adaptation in<em> C. elegans</em
Summary
Her beskriver vi en molekylær udlæsning af langsigtet olfaktoriske tilpasning i<em> Caenorhabditis elegans</em>. The Protein Kinase G, EGL-4, er nødvendig for stabile tilpasningsforanstaltninger i den primære sensoriske neuron par kaldes AWC. Under langvarig lugt eksponering EGL-4 translokerer fra cytosolen til cellekernen af AWC.
Abstract
Under vedvarende stimulation mest sensoriske neuroner vil tilpasse deres svar ved at nedsætte deres følsomhed over for signalet. Tilpasningen svar hjælper form opmærksomhed og også beskytter celler fra overstimulering. Tilpasning i den olfaktoriske kredsløb C. elegans blev først beskrevet af Colbert og Bargmann 1,2. Her forfatterne definerede parametre af det olfaktoriske tilpasning paradigme, som de brugte til at designe en genetisk skærm til at isolere mutanter defekte i deres evne til at tilpasse sig flygtige dufte følt af Amphid Wing celler type C (AWC) sensoriske neuroner. Når vildtype C. elegans dyrene udsættes for en attraktiv AWC-affølte lugt 3 for 30 min de vil tilpasse deres modtagelighed over for lugt og vil ignorere tilpasning af lugt i et kemotaksi adfærdsmæssige assay for ~ 1 time. Når vildtype C. elegans dyrene udsættes for et attraktivt AWC-fornemmede lugt for ~ 1 time, de vil derefter ignorere den tilpasning af lugt i achemotaxis adfærdsmæssige assay for ~ 3 timer. Disse to faser af olfaktoriske tilpasning i C. elegans blev beskrevet som kortsigtet olfaktoriske tilpasning (induceret efter 30 min lugt eksponering), og langvarig olfaktoriske tilpasning (induceret efter 60 min lugt eksponering). Senere arbejde fra L'Etoile et al., 4 afslørede en proteinkinase G (PKG) kaldet EGL-4, som er nødvendig for både den kortsigtede og langsigtede olfaktoriske tilpasning i AWC neuroner. Den EGL-4-protein indeholder en nuklear lokalisering sekvens, der er nødvendig for langsigtede olfaktoriske tilpasningsforanstaltninger men undværlige for kortsigtede olfaktoriske tilpasningsforanstaltninger i AWC 4. Ved at mærke EGL-4 med et grønt fluorescerende protein, var det muligt at visualisere lokaliseringen af EGL-4 i AWC ved langvarig lugt eksponering. Brug af denne fuldt funktionelle GFP-mærkede EGL-4 (GFP :: EGL-4) molekyle, vi har været i stand til at udvikle en molekylær udlæsning af langvarig lugte tilpasning i AWC 5. Brug af denne molecular udlæsning af olfaktoriske tilpasning har vi været i stand til at udføre både frem og bak genetiske skærme til at identificere muterede dyr, der udviser defekte subcellulære lokalisering mønstre af GFP :: EGL-4 i AWC 6,7. Her beskriver vi: 1) opførelse af GFP :: EGL-4 udtrykker dyr, 2) for dyrkning af dyr for langsigtede lugt-induceret kernetranslokation assays, og 3) scoring af den langsigtede lugt-induceret kernetranslokation begivenhed og nyttiggørelse (re-overfølsomhed) fra det nukleare GFP :: EGL-4 stat.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den lugt-induceret nukleare indtastning af en GFP-mærket EGL-4 molekylet beskrevet her giver en robust molekylær udlæsning af olfaktoriske tilpasning i C. elegans. De lugt-inducerede kernetranslokation assays er ligetil og kræver kun få dages forberedelsestid. Den pyIs500 dyr, som vi har fremstillet til disse assays, udtrykker en markør, der oplyser AWC neuron og udtrykker GFP-mærket EGL-4-protein. Således mener vi, at en eksperimentator med lidt at ingen erfaring med at arbejde med denne klass…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Scott Hamilton, og medlemmer af O'Halloran lab for omhyggelig læsning af dette manuskript. Vi takker også vores anonyme reviewer for gode forslag og indsigtsfulde kommentarer.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | DF0140-07-4 | NGM plates |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S671-10 | NGM plates |
| Bacto Peptone | Difco | DF0118-07-2 | NGM plates |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S375-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | S-Basal buffer and NGM plates |
| Kimwipes – Small | Kimberly-Clark | LS2770 | |
| Ethanol 100% | Gold Shield Chemical Co. | 43196-115 | diluting odors for chemotaxis assays |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C8106-500G | NGM plates |
| Magnesium Sulphate | MP Biomedicals | 150136-500G | NGM plates |
| Sodium Azide 99% | Fisher Scientific | ICN10289180 | Anesthetic |
| Agarose – UltraPure | Invitrogen | 16500-500 | Agarose pads |
| Benzaldehyde | Sigma-Aldrich | B1334-100G | AWC odor |
| Butanone, ACS Grade | Sigma-Aldrich | 360473-500ML | AWC odor |
| Microcentrifuge Tubes – 1.5 ml Colored | Denville | LS8147 | |
| Pasteur Pipet Disposable Glass 5-3/4″ | Fisher Scientific | 13-678-20B | |
| Stratalinker | Stratagene | Stratalinker 2400 | UV integration |
| Filter Vacuum Bottle – 500 ml | Nalgene | 09-740-25B |
References
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14 (4), 803 (1995).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learning and Memory. 4 (2), 179 (1997).
- Bargmann, C. I., et al. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Neuron. 74 (3), 515 (1993).
- L’Etoile, N. D., et al. The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans. Neuron. 36, 1079-10 (2002).
- Lee, J. I., et al. Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation. PNAS. 107 (13), 6016 (2010).
- O’Halloran, D. M., et al. Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (12), e1000761 (2009).
- O’Halloran, D. M., et al. Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 7 (2), e31614 (2012).
- Mello, C. C., et al. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).
- Miyabayashi, T., et al. Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 215, 314 (1999).
- L’Etoile, N. D., Bargmann, C. I. Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1. Neuron. 25 (3), 575 (2000).
- Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. Wormbook. , (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71 (1974).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson’s Disease Genes. J. Vis. Exp. (17), e835 (2008).
- Pittenger, C., Kandel, E. R. In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757 (2003).
