Undersøgelse af DNA beskadigelse checkpoint'et ved hjælp<em> Xenopus</em> Æg Ekstrakter

Summary

Xenopus æggeekstrakt er et nyttigt model-system til at undersøge DNA beskadigelse checkpoint'et. Denne protokol er til fremstilling af Xenopus æg ekstrakter og DNA beskadigelse checkpoint'et inducerende reagenser. Disse teknikker kan tilpasses til en række DNA-ødelæggende fremgangsmåder i undersøgelsen af ​​DNA beskadigelse checkpoint'et signalering.

Abstract

På daglig basis, er celler underkastes en række forskellige endogene og miljømæssige fornærmelser. For at bekæmpe disse fornærmelser er celler udviklet DNA beskadigelse checkpoint signalering som en overvågningsmekanisme til at fornemme DNA-skader og direkte cellulære reaktioner på DNA-skader. Der er flere grupper af proteiner kaldet sensorer, transducere og effektorer er involveret i DNA beskadigelse checkpoint'et signalering (fig. 1). I denne komplekse signalvejen, er ATR (ATM og Rad3-relateret) en af ​​de store kinaser der kan reagere på DNA-beskadigelse og replikation stress. Aktiveret ATR kan phosphorylere dens downstream substrater såsom Chk1 (Checkpoint kinase 1). Følgelig phosphoryleret og aktiveret Chk1 fører til mange downstream effekter i DNA beskadigelse checkpoint'et herunder cellecyklusstandsning, transkriptionsaktivering, DNA-beskadigelse reparation, og apoptose eller fremadskridende alderdom (figur 1). Når DNA er beskadiget, ikke at aktivere DNA beskadigelse checkpoint'et resulterer i unrepluftet skade og efterfølgende genomisk ustabilitet. Undersøgelsen af ​​DNA skade checkpoint vil belyse, hvordan cellerne opretholder genomisk integritet og give en bedre forståelse af, hvordan humane sygdomme, såsom kræft, udvikle sig.

Xenopus laevis æg ekstrakter dukker op som en kraftfuld cellefri ekstrakt modelsystem i DNA beskadigelse checkpoint'et forskning. Lav hastighed ekstrakt (LSE) blev oprindeligt beskrevet af Masui gruppe ^1. Tilsætningen af ​​demembranated sperm chromatin til LSE resulterer i kerner dannelse hvor DNA replikeres i en semi måde gang pr cellecyklus.

Den ATR/Chk1-mediated checkpoint signalvejen udløses af DNA-beskadigelse eller replikation stress ^2. To metoder anvendes for tiden til at inducere DNA beskadigelse checkpoint: DNA-ødelæggende metoder og DNA-skader der efterligner strukturer ^3. DNA-beskadigelse kan induceres af ultraviolet (UV) bestråling, γ-bestråling, methyl methanesulfonate (MMS), mitomycin C (MMC), 4-nitroquinolin-1-oxid (4-NQO), eller aphidicolin ^{3, 4.} MMS er et alkyleringsmiddel, der inhiberer DNA-replikation og aktiverer ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et ^4-7. UV-bestråling også udløser ATR/Chk1-dependent DNA-skader checkpoint ^8. Den DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70 er et udglødet kompleks af to oligonucleotider poly-(dA) 70 og poly-(dT) 70. Det AT70-systemet blev udviklet i Bill Dunphy laboratorium og er almindeligt anvendt til at fremkalde ATR/Chk1 checkpoint signalering ^9-12.

Her beskriver vi protokoller (1) til fremstilling af cellefrie ekstrakter æg (LSE), (2) at behandle Xenopus spermakromatin med to forskellige DNA-ødelæggende fremgangsmåder (MMS og UV), (3) til fremstilling af DNA-beskadigelse-efterlignende struktur AT70, og (4) at udløse ATR/Chk1-mediated DNA beskadigelse checkpoint'et i LSE med beskadiget spermakromatin eller en DNA-beskadigelse-efterlignende struktur.

Protocol

1. LSE Forberedelse Kvindelige frøer (Xenopus laevis) injiceres to gange for ægudtagning. Den første injektion (priming) er 100 U PMSG (Gravid Mare Serum Gonadotropin) per frø. Frøer primes mindst to dage før induktion æglægning og primede frøer kan anvendes i op til to uger. Til premierminister frøer, PMSG subkutant i de dorsale lymfeknuder sacs anvendelse af en 3 ml sprøjte og 27 G nål injiceres. For at inducere æglægning, injiceres 500 U hCG (humant choriongonadotropin) pr …

Discussion

Der er flere fordele ved at studere DNA beskadigelse checkpoint ved hjælp af Xenopus æg ekstrakter. Anvendelsen af ​​æg ekstrakter giver en stor mængde cellefri ekstrakter synkroniseret ved interfasen af ​​cellecyklussen. Ægget ekstrakter kan let og billigt fremstillet. Det er relativt let at beskadige DNA eller kromatin og at afsløre en fejl i DNA beskadigelse checkpoint'et efter immunodepleting et målprotein fra æggeekstrakt. Efterfølgende kan en potentiel funktion defekt blive "redd…

Materials

			Reagents
Anti-Chk1 P-S344 antibody	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 antibody	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximide	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cysteine	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methyl methanesulfonate (MMS)	Sigma	129925-5G
Nocodazole	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Sample buffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Equipment
Bucket for egg laying	Rubbermaid commercial products	6308
CL2 IEC centrifuge with swinging bucket rotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 swinging bucket rotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 plus superspeed centrifuge	Thermo Scientific	46910
UV crosslinker	UVP	95-0174-01
			Solutions
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, adjust pH to 7.8 with 10 M NaOH
Aprotinin/Leupeptin stock			10 mg/ml each in water. Store 20 μl aliquots at -80 °C.
Buffer X			0.2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, adjust pH to 7.5 by HCl
Cycloheximide stock			10 mg/ml in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
Cytochalasin B stock			5 mg/ml in DMSO. Store 20 μl aliquots at -20 °C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in water. Store 1 ml aliquots at -20 °C.
ELB			0.25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 μg/ml cycloheximide, 2.5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazole stock			10 mg/ml in DMSO. Store 5 μl aliquots at -80 °C.
Energy Mixture			375 mM creatine phosphate, 50 mM ATP, and 25 mM MgCl2. Aliquots are saved at -80 °C.
Nuclear dye solution			0.4 μg/ml Hoechst 33258, 25% glycerol (v/v), in 1x PBS
Tautomycin stock			100 μM in DMSO. Store 10 μl aliquots at -80 °C.