Summary

Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

Published: May 02, 2013
doi:

Summary

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Abstract

Resposta de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é um rápido em manifestação in vivo da resposta imunitária dependente da célula T a um antigénio exógeno (Ag), de que o sistema imunitário do hospedeiro tem tido no passado recente. Reacções DTH são frequentemente dividido numa fase de sensibilização, referindo-se a experiência inicial de antigénio, e uma fase de desafio, o que geralmente resulta de vários dias após a sensibilização. A falta de uma resposta de hipersensibilidade tardia a um Ag recuperação demonstrada pelo teste de pele é frequentemente considerado como uma evidência de anergia. O ensaio de DTH tradicional tem sido usado eficazmente no diagnóstico de várias infecções microbianas.

Apesar partilhando características imunológicas similares, tais como a infiltração de linfócitos, edema e necrose do tecido, o DTH directa não é uma técnica viável de diagnóstico em doentes transplantados, devido à possibilidade de injecção directa, resultando na sensibilização para antigénios do dador e perda do enxerto. Para evitar este problema, o zumbidoum-para-rato de "trans-vivo" ensaio de DTH foi desenvolvido 1,2. Este teste é, essencialmente, um ensaio de transferência de DTH, em que as células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e antigénios específicos foram injectados por via subcutânea na pata traseira ou pinas de um rato ingénuos e DTH-como inchaço é medido após 18-24 h 3. A apresentação de antigénio por células apresentadoras de antigénios humanos, tais como macrófagos ou células dendríticas para as células T no tecido altamente vascularizado rato desencadeia a cascata inflamatória e atrai as células imunes do rato, resultando em respostas do inchaço. A resposta é específica para o antigénio e requer sensibilização antigénio antes. Uma resposta DTH dador reactivo positivo no ensaio de DTH Tv reflecte que o paciente de transplante desenvolveu uma disposição imunológica pró-inflamatória para aloantigénios de garfo.

A característica mais importante deste ensaio é que ele pode também ser usado para detectar células T reguladoras, que causam a supressão de espectador. Supressão de um espectadorSensibilidade resposta DTH na presença do antigénio do doador é característico dos receptores de transplante com aloenxertos aceites 2,4-14. O monitoramento de pacientes transplantados para alloreactivity e regulação por Tv-DTH pode identificar um subgrupo de pacientes que poderiam se beneficiar de redução da imunossupressão sem risco elevado de rejeição ou de deterioração da função renal.

Uma área promissora é a aplicação do ensaio de DTH em Tv-vigilância da autoimunidade 15,16 e também na área da imunologia tumoral 17.

Protocol

1. Preparação de Linfócitos Coletar sangue para ACD (ácido citrato dextrose) tubos. Isolar CMSP a partir de sangue periférico humano fresco, utilizando Meio de Separação de Linfócitos de acordo com métodos padrão. Lavar as PBMC três vezes com PBS para remover as plaquetas contaminantes. As plaquetas foram encontrados para interferir com o ensaio de trans-DTH in vivo. Máximo permitido de contaminação de plaquetas preparação PBMC é ≤ 1×10 7 / injeção. <li…

Representative Results

1. Avaliação dos receptores de transplante renal para a resposta antígeno-específica de doadores usando ensaio Tv-DTH Para testar o doador reactivo imunidade celular em pacientes transplantados renais foram injetados PBMC de pacientes com estes antigénios do dador, isoladamente ou com um antigénio de toxóide do tétano (TT). Como um controlo positivo de células foram injectadas com o TT por si só. Observamos três padrões principais de tipo de hipersensibilidade retardada em receptore…

Discussion

O ensaio de DTH trans in vivo é um teste de diagnóstico de novo com uma aplicação potencial clínico para avaliar as respostas mediadas por células em transplantes, cancro e pacientes auto-imunes. É importante porque não só é útil no monitoramento de recall T efetoras respostas, mas também pode detectar respostas T reguladoras. A maneira confiável para detectar regulação DTH humano pode prever a segurança da retirada da imunossupressão em pacientes que são candidatos à monoterapia ou tolerância ensaio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer as contribuições da AM VanBuskirk para o desenvolvimento da nossa compreensão da resposta DTH regulado em receptores de transplante. Este trabalho foi apoiado bolsas NIH PO1AI084853 e R01AI066219-06 e da UE-patrocinado um estudo.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
ACD tube for blood collection BD 02-684-26  
Lymphocyte Separation Medium Cellgro 25-072-CV  
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Cellgro 21-031-CM Without calcium & magnesium
ACK Lysis Buffer BioWhittaker 10-548E  
TT/DT or EBV Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.   TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection
Protease inhibitor PMSF Sigma-Aldrich 78830  
Eosine for cell count Sigma-Aldrich E-6003  
Alloantigen     Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates
50 ml sterile centrifuge tubes Fisher Scientific 06-443-18  
10 ml pipettes and pipettor BD Falcon 13-675-20  
2 ml safe-lock tubes Costar 3213  
1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips      
Hemocytometer Fisher 02-671-10  
Full size centrifuge and microfuge Beckman Coulter/Eppendorf    
1/2cc or 1cc insulin syringes Becton Dickinson 14-826-79 28 gauge
Vibracell sonicator Divtech Equipment Co. Sonocs& Materials Inc   2 mm probe
Dial thickness gauge Mitutoyo, Japan    
SCID mice Harlan    
Isoflurane Piramal Healthcare   Inhalant anesthesia

References

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Cite This Article
Jankowska-Gan, E., Hegde, S., Burlingham, W. J. Trans-vivo Delayed Type Hypersensitivity Assay for Antigen Specific Regulation. J. Vis. Exp. (75), e4454, doi:10.3791/4454 (2013).

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