Trans-vivo Atraso Tipo Ensaio Hipersensibilidade para o Antigen Regulamento Específico

Resumo

Descreve-se um ensaio de diagnóstico potencialmente valiosa, que pode ser utilizada para decidir a retirada da imunossupressão após transplante sem risco elevado de rejeição do enxerto. O ensaio utiliza os princípios do tipo hipersensibilidade cutânea tardia e fornece uma avaliação precisa do dador respostas imunes efetoras e reguladoras específicas montadas pelos destinatários.

Resumo

Resposta de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH) é um rápido em manifestação in vivo da resposta imunitária dependente da célula T a um antigénio exógeno (Ag), de que o sistema imunitário do hospedeiro tem tido no passado recente. Reacções DTH são frequentemente dividido numa fase de sensibilização, referindo-se a experiência inicial de antigénio, e uma fase de desafio, o que geralmente resulta de vários dias após a sensibilização. A falta de uma resposta de hipersensibilidade tardia a um Ag recuperação demonstrada pelo teste de pele é frequentemente considerado como uma evidência de anergia. O ensaio de DTH tradicional tem sido usado eficazmente no diagnóstico de várias infecções microbianas.

Apesar partilhando características imunológicas similares, tais como a infiltração de linfócitos, edema e necrose do tecido, o DTH directa não é uma técnica viável de diagnóstico em doentes transplantados, devido à possibilidade de injecção directa, resultando na sensibilização para antigénios do dador e perda do enxerto. Para evitar este problema, o zumbidoum-para-rato de "trans-vivo" ensaio de DTH foi desenvolvido ^1,2. Este teste é, essencialmente, um ensaio de transferência de DTH, em que as células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) e antigénios específicos foram injectados por via subcutânea na pata traseira ou pinas de um rato ingénuos e DTH-como inchaço é medido após 18-24 h ^3. A apresentação de antigénio por células apresentadoras de antigénios humanos, tais como macrófagos ou células dendríticas para as células T no tecido altamente vascularizado rato desencadeia a cascata inflamatória e atrai as células imunes do rato, resultando em respostas do inchaço. A resposta é específica para o antigénio e requer sensibilização antigénio antes. Uma resposta DTH dador reactivo positivo no ensaio de DTH Tv reflecte que o paciente de transplante desenvolveu uma disposição imunológica pró-inflamatória para aloantigénios de garfo.

A característica mais importante deste ensaio é que ele pode também ser usado para detectar células T reguladoras, que causam a supressão de espectador. Supressão de um espectadorSensibilidade resposta DTH na presença do antigénio do doador é característico dos receptores de transplante com aloenxertos aceites ^2,4-14. O monitoramento de pacientes transplantados para alloreactivity e regulação por Tv-DTH pode identificar um subgrupo de pacientes que poderiam se beneficiar de redução da imunossupressão sem risco elevado de rejeição ou de deterioração da função renal.

Uma área promissora é a aplicação do ensaio de DTH em Tv-vigilância da autoimunidade ^15,16 e também na área da imunologia tumoral ^17.

Protocolo

1. Preparação de Linfócitos

1. Coletar sangue para ACD (ácido citrato dextrose) tubos.
2. Isolar CMSP a partir de sangue periférico humano fresco, utilizando Meio de Separação de Linfócitos de acordo com métodos padrão.
3. Lavar as PBMC três vezes com PBS para remover as plaquetas contaminantes. As plaquetas foram encontrados para interferir com o ensaio de trans-DTH in vivo. Máximo permitido de contaminação de plaquetas preparação PBMC é ≤ 1x10 ⁷ / injeção.
4. Se houver uma contaminação de glóbulos vermelhos perceptível, realizar a lise de glóbulos vermelhos usando tampão de lise ACK após a primeira lavagem. Remover tampão ACK....

Resultados

1. Avaliação dos receptores de transplante renal para a resposta antígeno-específica de doadores usando ensaio Tv-DTH

Para testar o doador reactivo imunidade celular em pacientes transplantados renais foram injetados PBMC de pacientes com estes antigénios do dador, isoladamente ou com um antigénio de toxóide do tétano (TT). Como um controlo positivo de células foram injectadas com o TT por si só. Observamos três padrões principais de tipo de hipersensibilidade retardada em receptores de transpl.......

Discussão

O ensaio de DTH trans in vivo é um teste de diagnóstico de novo com uma aplicação potencial clínico para avaliar as respostas mediadas por células em transplantes, cancro e pacientes auto-imunes. É importante porque não só é útil no monitoramento de recall T efetoras respostas, mas também pode detectar respostas T reguladoras. A maneira confiável para detectar regulação DTH humano pode prever a segurança da retirada da imunossupressão em pacientes que são candidatos à monoterapia ou tolerância ensaios.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo ACD para coleta de sangue	BD	02-684-26
Meio de Separação de Linfócitos	Cellgro	25-072-CV
Salina Fosfato Tamponada de Dulbecco	Cellgro	21-031-CM	Sem cálcio && magnésio
Tampão de lise ACK	BioWhittaker	10-548E
TT/DT ou EBV	Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc.		TT/DT 25 μg/injeção EBV 8 μg/injeção
Inibidor de protease PMSF	Sigma-Aldrich	78830
Eosina para contagem de células	Sigma-Aldrich	E-6003
Aloantígeno			Antígenos HLA purificados, peptídeos alo-sintéticos podem ser usados em vez de lisados livres de células doadoras
Tubos de centrífuga estéreis de 50 ml	Fisher Scientific	06-443-18
Pipetas de 10 ml e pipetador	BD Falcon	13-675-20
tubos seguros de 2 ml	Costar	3213
1000 μl, 100 μl, 10 μpipetas com ponteiras estéreis
Hemocitômetro	Fisher	02-671-10
Centrífuga de tamanho completo e microcentrífuga	Beckman Coulter/Eppendorf
Seringas de insulina de 1/2 cc ou 1 cc	Becton Dickinson	14-826-79	28 gauge
Sonicador Vibracell	Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc		sonda de 2 mm
Medidor de espessura de disco	Mitutoyo, Japão
camundongos SCID	Harlan
Isoflurano	Piramal Healthcare		Anestesia inalatória