Blastomer Eksplantater at teste for Cell Fate Commitment under fosterudviklingen

Summary

Den skæbne af en individuel embryocelle kan påvirkes af arvelige molekyler og / eller ved hjælp af signaler fra naboceller. Anvendelse skæbne kort over spaltning fase Xenopus embryo, kan enkelte blastomeres identificeres til dyrkning isoleret for at vurdere bidraget af nedarvede molekyler versus celle-celle interaktioner.

Abstract

Skæbne kort, konstrueret af slægt spore alle celler af et embryon, afslører hvilke væv ned fra hver celle af embryoet. Selvom skæbne maps er meget nyttige til at identificere de forstadier til et organ og til at belyse udviklingsmæssige bane, hvorved efterkommere celler befolker dette organ i den normale foster, de ikke viser det fulde udviklingspotentiale en precursorcelle eller identificere de mekanismer, som sin skæbne bestemmes. For at teste for celle skæbne engagement, man sammenligner en celle normale repertoire af efterkommere i den intakte embryo (den skæbne kort) med dem, der udtrykkes efter en eksperimentel manipulation. Er cellens skæbne fastsat (engagerede), uanset det omgivende cellulære miljø, eller er det påvirket af eksterne faktorer, som sine naboer? Brug af omfattende skæbne kort over Xenopus foster, vi beskriver, hvordan at identificere, isolere og kultur enkelt spaltningsprodukter fase forstadier, kaldet blastoMeres. Denne tilgang gør det muligt at vurdere, om disse tidlige celler er forpligtet til den skæbne, de får deres normale miljø i den intakte embryo, kræver interaktion med deres naboceller, eller kan påvirkes til at udtrykke alternative skæbner, hvis de udsættes for andre typer signaler.

Introduction

Xenopus laevis embryoer er blevet anvendt i vid udstrækning til at identificere de mekanismer, som embryonale celler erhverver deres specifikke skæbner fordi deres æg er store nok til at tillade mikrokirurgiske tilgange. Desuden udvikler de eksternt uden behov for kosttilskud af dyrkningsmediet, da hver celle indeholder en rig intracellulær forsyning af æggeblomme blodplader, der giver en iboende energilager. Et vigtigt aktiv for at studere de mekanismer, der celle skæbne bestemmes, er det omfattende sæt af skæbne kort over de spalt fase blastomeres (fra 2 – via 32-celle faser) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Disse kort blev konstrueret ved microinjecting et påviseligt molekyle i et enkelt, identificerbar blastomer og overvåge senere i udvikling, som væv er befolket af det mærkede afkom. Konsekvent skæbne maps er muligt, fordi de kardinale akser embryoner kan identificeres pålideligt i mange EmbryOS. Først i alle vildtype embryoner dyret halvkugle er pigmenteret, hvorimod vegetabilsk halvkugle ikke er. For det andet indførelsen af ​​sperm ved befrugtningen forårsager en sammentrækning af dyret halvkugle pigmentering hen imod den fremtidige ventrale side, i mange fostre en pigmentering forskel kan derfor anvendes til at skelne mellem dorsale og ventrale sider. For det tredje den første spaltning fure tilnærmer midten af ​​sagittalplanet i de fleste embryoner og kan således anvendes til at identificere de højre og venstre side af embryoet. Den skæbne maps også påberåbe sig, at naturligt befrugtede æg ofte spaltes i regelmæssige mønstre, der gør hver blastomer identificeres på tværs af en stor population af embryoner. Mens der er variation inden for og mellem kløerne på æg om pigmentforandringer og spaltning mønstre, ved hjælp af udvælgelsesprocedurer beskrevet heri tillader celler med foreskrevne skæbner at blive identificeret med omkring 90% nøjagtighed.

Celleskæbner kan afskrækkebestemmes under embryogenese ved adskillige mekanismer. Intrinsic faktorer, såsom differentielt nedarvede cytoplasmiske mRNA'er eller proteiner, bidrager til flere aspekter af tidlig mønster. For eksempel fastlægge specifikke maternelle mRNA'er hvilke celler der bidrager til kimcellelinjen, bliver endoderm eller bidrager til den dorsale organ akse (revideret i ^7). Eksterne faktorer, der er fastsat lokalt af tilstødende celler eller mere fjernt fra et embryonisk fjernstyringscentral, er ansvarlige for at inducere specifikke vævstyper og mønster næsten alle organsystemer. Eksempler på signalering centre omfatter rejsearrangøren / node i gastrula der inducerer det neurale ektoderm og mønstre mesoderm, og zonen for polariserende aktivitet, mønstre anterior-posteriore akse lem-knop. Selvom skæbne maps identificere forstadier til de forskellige organer og afsløre den udviklingsmæssige bane, som deres efterkommere i den normale foster, kan de ikke skelne mellem iboendeog ekstrinsiske indflydelse på disse celler. De har heller ikke afsløre det fulde udviklingspotentiale af en celle, hvis efterkommere differentiere i komplekset signalering miljø af embryoet. To eksperimentelle tilgange kan teste, om en celles skæbne bestemmes af iboende faktorer eller efterfølgende afhængig af eksterne faktorer: 1) transplantation af cellen til en ny placering i embryoet, eller 2) at fjerne en celle fra embryonet efterfulgt af dyrkning i fravær af exogene signaler.

Både eksperimentelle fremgangsmåder har været mulig i Xenopus fordi cellerne er store nok til at blive manuelt adskilt. For eksempel har adskillige undersøgelser udgår enkelte celler fra embryoer (for at ændre celle-celle interaktioner) eller transplanterede celler til nye steder i værts-embryoer at teste for skæbne ændringer (revideret i ^{7, 8, 9).} Hertil kommer, i den anden tilgang eksplanteres små antal af celler fra forskellige egne af embryonto kultur at belyse induktive væv interaktioner i fravær af exogene faktorer er muligt, fordi cellerne i Xenopus embryo er fyldt med en intracellulær næringsstof butik, blommen blodplader. Derfor kan de dyrkes i nogle dage på et defineret salt medium uden ernæringsmæssig eller vækstfaktor supplement af dyrkningsmediet. Vi har anvendt denne metode til at vise, at de dorsale dyr blastomeres har en selvstændig evne til at producere neurale og dorsale mesodermale væv på grund af moderen nedarvet mRNA'er ^{10, 11,} og andre viste, at mesoderm specifikation af 32-celle blastomeres afhængig af både interne og eksterne information ¹² . En fordel ved dyrkning af celler som eksplantater er, at mediet også kan suppleres med definerede signalering faktorer til at bestemme, hvilken celle-til-celle kommunikation pathway kan påvirke skæbne af det eksplanterede cellen ^{12, 13, 14.} Desuden kan man injicere blastomer prior dyrkning med mRNA til overudtrykker et gen, eller med antisense-oligonukleotider for at forhindre translation af endogene mRNA'er. Disse, gain-og tab-af-funktion analyser kan identificere, hvilke molekyler er nødvendige for en autonomt udtrykt skæbne. For at analysere skæbne eksplantatet, kan identifikation af specifikke celletyper udføres ved standard-genekspression (fx, in situ hybridisering, RT-PCR) og immuncytokemiske analyser. Denne protokol giver en enkel, men kraftfuld, måde at skelne mellem indre og ydre mekanismer, der regulerer, hvordan en embryonisk celle udvikler sig til specifikke væv.

Protocol

1. Udarbejdelse af Instrumenter, dyrkningsmedier og Dishes Skærpe fire pincet under anvendelse aluminiumoxidslibemiddel film. Gør dette under et dissektionsmikroskop at overvåge tip-størrelse. Et par af tang fungerer som en back-up i tilfælde en spids beskadiges under proceduren. Autoklavér alle fire pincet og gemme i en steril beholder. Lav 500 ml hver 0,1 x og 1,0 x dyrkningsmedium (enten Marcs Modified Ringers [MFR] eller modificeret Barth saltvand [MBS], opskrifter i 15) og filt…

Representative Results

Evnen hos dette assay præcist at vurdere den udviklingsmæssige potentiale af cellen afhængig dissekere den korrekte blastomer baseret på skæbne kort 1, 2, 3, 4, 5, 6. Det er derfor vigtigt at vælge embryoer med den korrekte pigmentering mønster på 2-celle stadiet, som vist i figur 1, som derefter i overensstemmelse med regelmæssige spaltningsmønstrene, som illustreret i figur 2. Hvis man overholder de sorterede embryoner når den krævede spaltning scenen og frasort…

Discussion

De mest kritiske trin for vellykket dyrkning af individuelle blastomerer er: 1) korrekt identifikation af blastomer af interesse, 2) opretholde et sterilt, sund kultur, 3) dissekere celler i den korrekte del af cellecyklus, og 4) at udvikle de nødvendige manuelle fingerfærdighed til at forebygge skader under dissektion og overføre til kulturen godt.

At manipulere bestemte blastomeres, er det vigtigt at være i stand til at identificere de kardinalpunkter akser. I Xenopus embryoer…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use