ब्लास्टोमीयर explants सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए भ्रूण विकास के दौरान टेस्ट

Summary

एक व्यक्ति भ्रूण सेल के भाग्य विरासत में मिला अणुओं और / या पड़ोसी कोशिकाओं से संकेतों से प्रभावित किया जा सकता है. उपयोग दरार चरण Xenopus भ्रूण के भाग्य नक्शे, एकल blastomeres अलगाव में संस्कृति के लिए पहचाना जा सकता है सेल सेल बातचीत के बनाम विरासत अणुओं के योगदान का आकलन करें.

Abstract

किस्मत नक्शे, एक भ्रूण की कोशिकाओं के सभी वंश अनुरेखण से निर्माण से पता चलता है जो ऊतकों भ्रूण की प्रत्येक कोशिका से उतर. हालांकि भाग्य नक्शे के एक अंग के व्यापारियों की पहचान करने के लिए और विकास पथ जिसके द्वारा वंशज कोशिकाओं सामान्य भ्रूण में उस अंग आबाद elucidating के लिए बहुत उपयोगी हैं, वे एक अग्रदूत सेल के पूर्ण विकास क्षमता नहीं उदाहरण देकर स्पष्ट करना या तंत्र की पहचान है जिसके द्वारा अपने भाग्य निर्धारित किया जाता है. करने के लिए सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए परीक्षण करने के लिए, एक अक्षुण्ण भ्रूण (भाग्य नक्शा) में एक प्रयोगात्मक हेरफेर के बाद व्यक्त की उन लोगों के साथ तुलना एक सेल वंश के सामान्य प्रदर्शनों की सूची. सेल भाग्य (प्रतिबद्ध) आसपास के सेलुलर पर्यावरण की परवाह किए बिना, तय है या यह अपने पड़ोसियों के द्वारा प्रदान की बाहरी कारकों से प्रभावित है? Xenopus भ्रूण के व्यापक भाग्य नक्शे का उपयोग करना, हम वर्णन कैसे पहचान करने के लिए, अलग और संस्कृति एक दरार चरण व्यापारियों, बहुतस से प्राणिविज्ञान संबंधी शब्दों में पहला पद जिसका अर्थ बीज, अंकुआ, अंकुर कली आदि होता है कहा जाता हैमेरेस. इस दृष्टिकोण का आकलन करने के लिए एक है कि क्या इन कोशिकाओं को जल्दी भाग्य वे बरकरार भ्रूण में अपने सामान्य वातावरण में प्राप्त करने के लिए, अपने पड़ोसी की कोशिकाओं के साथ बातचीत की आवश्यकता के लिए प्रतिबद्ध हैं, या वैकल्पिक भाग्य व्यक्त अगर संकेतों के अन्य प्रकार के लिए संपर्क करने के लिए प्रभावित किया जा सकता है की अनुमति देता है.

Introduction

Xenopus laevis भ्रूण बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है के लिए तंत्र है जिसके द्वारा भ्रूण कोशिकाओं को अपनी विशिष्ट भाग्य प्राप्त क्योंकि उनके अंडे काफी बड़े microsurgical दृष्टिकोण की अनुमति की पहचान. इसके अलावा, वे मध्यम संस्कृति के पोषण अनुपूरण के लिए आवश्यकता के बिना बाहर विकसित क्योंकि प्रत्येक कोशिका जर्दी प्लेटलेट्स कि एक आंतरिक ऊर्जा की दुकान उपलब्ध कराने के एक अमीर intracellular आपूर्ति शामिल है. ^{1, 2, 3, 4, 5, 6} – तंत्र है जिसके द्वारा सेल भाग्य निर्धारित किया जाता है का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण परिसंपत्ति दरार चरण blastomeres के भाग्य नक्शे (2 से 32 सेल के चरणों के माध्यम से) के व्यापक सेट है. इन मानचित्रों एक एकल, पहचान ब्लास्टोमीयर में एक detectable अणु microinjecting और विकास में बाद में निगरानी है जो ऊतकों लेबल संतान से बसा रहे हैं द्वारा निर्माण किया गया. लगातार भाग्य नक्शे संभव हो रहे हैं, क्योंकि भ्रूण के कार्डिनल अक्षों मज़बूती से कई Embry में पहचाना जा सकता हैओएस. सबसे पहले, सभी जंगली प्रकार के भ्रूण में पशु गोलार्द्ध pigmented है, जबकि वनस्पति गोलार्द्ध नहीं है. दूसरा, शुक्राणु का निषेचन में प्रवेश भविष्य ventral पक्ष की ओर पशु गोलार्द्ध pigmentation के एक संकुचन का कारण बनता है, कई भ्रूण में pigmentation अंतर इसलिए पृष्ठीय और उदर पक्षों के बीच भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. तीसरा, पहली दरार कुंड approximates ज्यादातर भ्रूण में विमान मध्य बाण के समान है, और इस तरह के भ्रूण के दाएँ और बाएँ पक्ष की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भाग्य नक्शे भी तथ्य यह है कि स्वाभाविक रूप से नियमित पैटर्न है कि प्रत्येक ब्लास्टोमीयर भ्रूण की एक बड़ी आबादी में पहचान बनाने में अंडे अक्सर फोड़ना निषेचित पर भरोसा करते हैं. जबकि वहाँ के भीतर और pigmentation और दरार पैटर्न के बारे में अंडे, चयन प्रक्रिया का उपयोग कर के चंगुल के बीच वर्णित परिवर्तनशीलता है यहाँ निर्धारित भाग्य के साथ कोशिकाओं के बारे में 90% सटीकता के साथ की पहचान करने की अनुमति देता है.

सेल भाग्य रोकते किया जा सकता हैकई तंत्र द्वारा embryogenesis दौरान खनन. Differentially विरासत cytoplasmic mRNAs या प्रोटीन के रूप में इस तरह के आंतरिक कारकों, जल्दी patterning के कई पहलुओं के लिए योगदान करते हैं. उदाहरण के लिए, विशिष्ट मातृ mRNAs निर्धारित जो कोशिकाओं रोगाणु लाइन के लिए योगदान, अन्तस्त्वक् बनने के होगा, या पृष्ठीय शरीर अक्ष ⁽⁷ में समीक्षा) के लिए योगदान है. बाह्य कारकों पड़ोसी कोशिकाओं या एक भ्रूण संकेत केंद्र से अधिक दूर से स्थानीय स्तर पर प्रदान की, विशिष्ट प्रकार के ऊतक और patterning लगभग हर अंग प्रणाली उत्प्रेरण के लिए जिम्मेदार हैं. संकेत केन्द्रों के उदाहरण / गेसट्रुला है कि तंत्रिका बाहरी झिल्ली और mesoderm पैटर्न लाती में आयोजक नोड, और गतिविधि ध्रुवीकरण के क्षेत्र शामिल हैं है कि पैटर्न अंग कली की धुरी पूर्वकाल – पीछे. हालांकि भाग्य नक्शे विभिन्न अंगों के व्यापारियों की पहचान और विकास सामान्य भ्रूण में उनके वंश द्वारा उठाए गए पथ प्रकट, वे आंतरिक बीच भेद नहीं कर सकतेऔर उन कोशिकाओं पर बाह्य प्रभाव. उन्होंने यह भी एक सेल, जिसका वंश भ्रूण की जटिल संकेत वातावरण में अंतर का पूर्ण विकास क्षमता प्रकट नहीं करते. दो प्रयोगात्मक दृष्टिकोण परीक्षण है कि एक सेल भाग्य आंतरिक कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है या बाद में बाहरी कारकों से प्रभावित कर सकते हैं: 1) भ्रूण में एक उपन्यास स्थान पर सेल के प्रत्यारोपण, या 2) भ्रूण से सेल के हटाने में संस्कृति के द्वारा पीछा exogenous संकेतों के अभाव.

दोनों प्रयोगात्मक दृष्टिकोण Xenopus में संभव हो गया है क्योंकि कोशिकाओं काफी बड़े के लिए मैन्युअल रूप से अलग किया जा रहे हैं. उदाहरण के लिए, कई अध्ययनों मेजबान भ्रूण में उपन्यास स्थानों (सेल सेल बातचीत बदलने) भ्रूण या प्रतिरोपित कोशिकाओं से एकल कक्षों भाग्य ⁽⁷ में परिवर्तन की ^{समीक्षा, 8, 9)} के लिए परीक्षण करने के लिए नष्ट कर दिया है. इसके अलावा भ्रूण के विभिन्न क्षेत्रों से कोशिकाओं के छोटे संख्या explanting के दूसरे दृष्टिकोण मैंNto exogenous कारकों के अभाव में आगमनात्मक ऊतक बातचीत स्पष्ट संस्कृति संभव है क्योंकि Xenopus भ्रूण की कोशिकाओं के एक intracellular पोषक तत्व की दुकान, जर्दी प्लेटलेट्स से भर रहे हैं. इसलिए, वे एक परिभाषित पोषण या मध्यम संस्कृति के विकास कारक अनुपूरण के बिना नमक मध्यम में कुछ दिनों के लिए संवर्धित किया जा सकता है. हम इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है कि पृष्ठीय पशु blastomeres एक स्वायत्त तंत्रिका और पृष्ठीय mesodermal माता के रूप में विरासत में मिला mRNAs ^{10, 11} के कारण ऊतकों का उत्पादन करने की क्षमता है, और दूसरों से पता चला है 32 सेल blastomeres कि mesoderm विनिर्देश दोनों आंतरिक और बाह्य ¹² जानकारी पर निर्भर करता है . Explants के रूप में संवर्धन कोशिकाओं का एक फायदा यह है कि मध्यम भी परिभाषित संकेत निर्धारित करने के लिए जो सेल करने वाली सेल संचार मार्ग explanted सेल ^{12, 13, 14} के भाग्य को प्रभावित हो सकता है कारकों के साथ पूरक किया जा सकता है. इसके अलावा, एक ब्लास्टोमीयर जनसंपर्क इंजेक्षन कर सकते हैंसंस्कृति को खत्म-the व्यक्त एक जीन, विरोधी भावना oligonucleotides के साथ या अंतर्जात mRNAs का अनुवाद को रोकने के लिए mRNA साथ आईओआर. ये, लाभ और हानि का समारोह विश्लेषण की पहचान कर सकते हैं जो अणुओं एक स्वायत्त व्यक्त भाग्य के लिए आवश्यक हैं. Explant के भाग्य का विश्लेषण करने के लिए विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की पहचान मानक जीन अभिव्यक्ति (जैसे, स्वस्थानी संकरण में, RT-पीसीआर) और immunocytochemical assays के द्वारा किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में एक सरल, अभी तक शक्तिशाली, आंतरिक और बाह्य तंत्र है कि विनियमित कैसे एक भ्रूण सेल विशिष्ट ऊतकों में विकसित के बीच अंतर करने के लिए रास्ता प्रदान करता है.

Protocol

1. उपकरण, संस्कृति, मीडिया और व्यंजन की तैयारी चार एल्यूमीना अपघर्षक फिल्म का उपयोग संदंश पैनापन. टिप आकार पर नजर रखने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत यह मत करो. संदंश की एक जोड़ी के रूप में कार्?…

Representative Results

इस परख की क्षमता को सही सेल के विकास की क्षमता का आकलन सही नक्शे 1, 2, 3, 4, 5, 6 के भाग्य पर आधारित ब्लास्टोमीयर विदारक पर निर्भर करता है. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि 2-सेल चरण में सही pigmentation पैटर्न के साथ भ्रूण क?…

Discussion

व्यक्तिगत blastomeres के सफल संवर्धन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) सही ढंग से ब्याज की ब्लास्टोमीयर की पहचान, 2) एक बाँझ, स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने, 3) कोशिका चक्र के सही भाग में विदारक कोशिकाओं, और 4) आवश्यक ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use