Blastomere explants å teste for Cell Fate Commitment under embryonal utvikling

Summary

Skjebne av en individuell embryonale celle kan være påvirket av nedarvede molekyler og / eller ved hjelp av signaler fra nabocellene. Utnytte skjebne kart over cleavage scenen Xenopus embryo kan enkle blastomeres identifiseres for kultur i isolasjon for å vurdere bidragene fra arvet molekyler versus celle-celle interaksjoner.

Abstract

Skjebne kart, konstruert fra avstamning sporing alle cellene i et embryo, avsløre hvilke vev ned fra hver celle av embryo. Selv skjebne kart er svært nyttig for å identifisere forløpere til et organ og for å belyse den utviklingsmessige banen der de etterkommer celler fylle det organ i normal embryo, har de ikke illustrere full utviklingsmessige potensialet i en forløper celle eller identifisere mekanismer som sin skjebne bestemmes. For å teste for celle skjebne engasjement, sammenligner man en celle normale repertoar av etterkommere i intakt embryo (skjebnen kart) med de uttrykte etter en eksperimentell manipulasjon. Er cellens skjebne fast (kommitterte) uavhengig av den omkringliggende mobilnettet miljøet, eller er det avhengig av eksterne faktorer levert av sine naboer? Bruke omfattende skjebne kart over Xenopus embryo, beskriver vi hvordan å identifisere, isolere og kultur enkelt cleavage stage forløpere, kalt blastoMeres. Denne fremgangsmåten gjør en å vurdere hvorvidt disse tidlige cellene er forpliktet til skjebne de tilegner i sitt normale miljø i intakt embryo, krever interaksjon med sine nærliggende celler, eller kan bli påvirket til å uttrykke alternative skjebner hvis de utsettes for andre typer signaler.

Introduction

Xenopus laevis embryoer har blitt utnyttet i stor utstrekning for å identifisere mekanismer som embryonale celler skaffe sine spesifikke skjebner fordi eggene sine er store nok til å tillate mikrokirurgiske tilnærminger. Tillegg utvikler de eksternt uten behov for ernæringsmessige supplering av dyrkningsmediet fordi hver celle inneholder en rik intracellulær tilførsel av eggeplomme blodplater som gir en iboende energilager. En viktig ressurs for å studere mekanismer som celle skjebne bestemmes er omfattende sett av skjebnen kart over de cleavage scenen blastomeres (fra 2 – gjennom 32-celle stadier) ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Disse kartene ble konstruert av microinjecting en påvisbar molekyl i en enkel, identifiserbar blastomere og overvåking senere i utviklingen som vev er befolket av merket avkom. Konsistente skjebne kart er mulig fordi kardinal akser embryoene kan bli pålitelig identifisert i mange Embryos. Først, i alle villtype embryoer dyret halvkule er pigmentert, mens vegetal halvkule er ikke. Sekund, fører oppføring av sædceller ved befruktning en sammentrekning av dyret halvkule pigmentering mot framtiden ventrale siden, men i mange embryoer en pigmentering forskjell kan derfor brukes til å diskriminere mellom dorsal og ventrale sider. Tredje, tilnærmer den første cleavage furen midten sagittalplan i de fleste embryoer, og således kan anvendes for å identifisere de høyre og venstre sider av embryoet. Skjebnen over også stole på at naturlig befruktede egg ofte kutter i vanlige mønstre som gjør hver blastomere identifiserbare over en stor bestand av embryoer. Mens det er variasjon innen og mellom klørne egg om pigmentering og cleavage mønstre, bruker utvelgelsesprosedyrer beskrevet gjør her celler med foreskrevne skjebner å bli identifisert med om lag 90% nøyaktighet.

Cell skjebner kan avskrekkeminelagt under embryogenese av flere mekanismer. Vesentlige faktorer, slik som differensielt arvet cytoplasmatiske mRNAer eller proteiner, bidra til flere aspekter av tidlig mønster. For eksempel spesifikke maternelle mRNAs bestemme hvilke celler vil bidra til kjønnsceller, bli endoderm, eller bidra til dorsal kroppen aksen (anmeldt i ^7). Extrinsic faktorer som tilbys lokalt av nabocellene eller mer fjernt fra en embryonale signalering sentrum, er ansvarlig for å indusere spesifikke vevstyper og mønster nesten alle organer system. Eksempler av signalmolekyler sentre inkluderer arrangør / noden i gastrula som induserer nevrale ektoderm og mønstre mesoderm, og sonen med polariserende aktivitet at mønstre anterior-posterior aksen av lem knopp. Selv skjebne kartene identifisere forløperne av de forskjellige organer og avsløre utviklingsmessige banen tatt av deres etterkommere i normal embryo, kan de ikke skille mellom iboendeog ytre påvirkninger på disse cellene. De også ikke avsløre hele utviklingsmessige potensialet i en celle, hvis etterkommere skille i det komplekse signaliserer miljø av embryo. To eksperimentelle tilnærminger kan teste hvorvidt en celle skjebne bestemmes av vesentlige faktorer eller er i ettertid påvirket av ytre faktorer: 1) transplantasjon av cellen til en roman plassering i embryo, eller 2) fjerning av cellen fra embryoet etterfulgt av kultur i fravær av eksogene signaler.

Både eksperimentelle tilnærminger har vært gjennomførbart i Xenopus fordi cellene er store nok til å bli manuelt atskilt. For eksempel har en rekke studier slettet enkeltceller fra embryoer (for å endre celle-celle interaksjoner) eller transplanterte celler til nye steder i vert embryoer å teste for skjebnen endringer (gjennomgått i ^{7, 8, 9).} I tillegg, den andre tilnærming eksplanteres lite antall celler fra forskjellige regioner av embryoet into kultur å belyse induktive vev interaksjoner i fravær av eksogene faktorer er mulig fordi cellene i Xenopus embryoet er fylt med en intracellulær næringsstoff butikk, eggeplomme blodplater. Derfor kan de bli dyrket i noen få dager i en definert salt medium uten ernæringsmessig eller vekstfaktor supplering av dyrkningsmediet. Vi har brukt denne tilnærmingen for å vise at dorsal dyr blastomeres har et autonomt evne til å produsere neurale og dorsal mesodermal vev grunnet mordyret arvet ^{10 mRNAs, 11,} og andre viste at mesoderm spesifikasjon av 32-celle blastomeres avhengig både indre og ytre informasjon ¹² . En fordel av dyrkning celler som eksplanter er at mediet kan også suppleres med definerte signalering faktorer for å finne hvilken celle-til-celle-kommunikasjon pathway kan påvirke skjebnen av eksplantert celle ^{12, 13, 14.} I tillegg kan en injisere blastomere prior til kultur med mRNA til over-express et gen, eller med anti-sense oligonukleotider å hindre oversettelse av endogene mRNAs. Disse, gevinst-og tap-av-funksjon analyser kan identifisere hvilke molekyler er nødvendig for en selvstendig uttrykk skjebne. Å analysere skjebnen til eksplantering, kan identifisering av spesifikke celletyper utføres av standard genekspresjon (f.eks in situ hybridisering, RT-PCR) og immuncytokjemisk analyser. Denne protokollen gir en enkel, men kraftig, måten å skille mellom indre og ytre mekanismer som regulerer hvordan en embryonal celle utvikler seg til spesifikke vev.

Protocol

1. Forberedelse av instrumenter, Dyrkningsmedier og retter Skjerpe fire tang med Alumina slipende film. Gjøre dette under en disseksjonsmikroskop å overvåke dysestørrelse. Ett pinsett fungerer som en back-up i tilfelle en dyse skadet under prosedyren. Autoklaveres alle fire pinsett og lagre i en steril beholder. Gjør 500 ml hver av 0.1X og 1.0x kultur medium (enten Marc modifiserte Ringers [MMR] eller endret Barth Saline [MBS]; oppskrifter i 15) og filter sterilisere. Vi rutinemessig…

Representative Results

Evnen av denne analysen for å nøyaktig vurdere utviklingsmessige potensialet av cellen er avhengig dissekere ut riktig blastomere basert på skjebnen 1 kartene, 2, 3, 4, 5, 6. Derfor er det viktig å velge embryoer med riktig pigmentering mønster på det 2-celle stadiet, som illustrert i figur 1, som senere oppfyller vanlige kutteseter mønstre, som vist i figur 2. Hvis man observerer sortert embryoer som de når ønsket cleavage scenen og skiller ut embryoene viser irregu…

Discussion

De mest kritiske trinn for vellykket dyrkning av individuelle blastomeres er: 1) fullstendig identifisere blastomere interessante, 2) å opprettholde en steril, sunn kultur, 3) dissecting celler ved den korrekte del av cellesyklusen, og 4) å utvikle den nødvendige manuelle fingerferdighet å unngå skader under disseksjon og overføre til kulturen godt.

Å manipulere spesifikke blastomeres, er det viktig å være i stand til å identifisere kardinal aksene. I Xenopus embryo kan ry…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-38	Course (12 μm), for major repairs of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-46	Medium (3 μm), for fine sharpening of forceps tips
Alumina abrasive film	Thomas Scientific	#6775E-54	Fine (0.3 μm), for polishing of forceps tips
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5	Fine Science Tools	#11252-30	These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. Corrosive resistant so they can be autoclaved.
Gentamicin solution	Sigma	G1397	Add to medium on same day as use