Fiberoptisk Implantation för kronisk optogenetic Stimulering av hjärnvävnad
Summary
Utvecklingen av optogenetics ger nu möjlighet att exakt stimulera genetiskt definierade nervceller och kretsar, både<em> In vitro</em> Och<em> In vivo</em>. Här beskriver vi montering och implantation av en fiberoptisk för kronisk fotostimulering av hjärnvävnad.
Abstract
Belysa mönster av nervkopplingar har varit en utmaning för både klinisk och grundläggande neurovetenskap. Elektrofysiologi har varit den gyllene standarden för att analysera mönster av synaptiska anslutningar, men parade elektrofysiologiska inspelningar kan vara både besvärligt och experimentellt begränsande. Utvecklingen av optogenetics har infört en elegant metod för att stimulera nervceller och kretsar, både in vitro 1 och in vivo 2,3. Genom att utnyttja celltypspecifik promotoraktivitet för att driva opsin uttryck i diskreta neuronala populationer, kan en stimulera just genetiskt definierade neuronala subtyper i distinkta kretsar 4-6. Väl beskrivna metoderna för att stimulera nervceller, däribland elektrisk stimulering och / eller farmakologiska manipulationer, ofta celltyp urskillningslöst, invasiv, och kan skada omgivande vävnader. Dessa begränsningar kan förändra normal synaptisk funktion och / eller krets beteende. Dessutom, på grundtill arten av manipulation, de nuvarande metoderna är ofta akut och terminal. Optogenetics ger förmågan att stimulera nervceller i ett relativt oskadliga sätt, och i genetiskt riktade neuroner. Majoriteten av studier in vivo optogenetics använder idag en optisk fiber leds genom en implanterad kanyl 6,7, men begränsningar av denna metod innefattar skadad hjärnvävnad med upprepat införande av en optisk fiber, och potentiella brott av fibern inuti kanylen. Med tanke på den spirande området optogenetics, är en mer tillförlitlig metod för kronisk stimulering för att underlätta långtidsstudier med minimal säkerhet vävnadsskada. Här ger vi vår modifierat protokoll som en video artikeln att komplettera förfarandet effektivt och elegant beskrivits i Sparta et al. 8 för tillverkning av en fiberoptisk implantat och dess permanent fixering på kraniet hos bedövade möss, liksom monteringen av fiberoptisk kopplare ansluter implantatet till en ljuskälla. Implantatet, förbunden med optiska fibrer till en solid-state laser, möjliggör en effektiv metod för att kroniskt photostimulate funktionell neuronala kretsar med mindre vävnadsskador 9 med små, avtagbara, tjuder. Permanent fixering av fiberoptiska implantat ger konsekvent och långsiktigt in vivo optogenetic studier av neuronala kretsar i vaken, beter möss 10 med minimal vävnadsskada.
Protocol
Discussion
Optogenetics är en kraftfull ny teknik som gör det möjligt oöverträffad kontroll över specifika neuronala subtyper. Detta kan utnyttjas för att modulera nervbanor med anatomisk och tidsmässig precision, samtidigt som man undviker celltyp urskillningslösa och invasiva effekter av elektrisk stimulering genom en elektrod. Implantation av fiberoptik möjliggör konsekvent, kronisk stimulering av neurala kretsar över flera sessioner i vaken, beter möss med minimal skada på vävnaden. Detta system, som ursprunglig…
Acknowledgements
Vi skulle vilja att erkänna att denna teknik som ursprungligen beskrevs av Sparta et al. 2012 och har lätt anpassas för användning i vårt labb.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
