Her beskriver vi en unik strategi for å skape biokompatible, lagdelte matriser med kontinuerlig grensesnitt mellom forskjellige lag for tissue engineering. Et slikt stillas kunne gi et ideelt tilpasses miljø for å modulere celle atferd av ulike biologiske, kjemiske og mekaniske signaler
Komplekse vevskultur matriser, i hvilke typer og konsentrasjoner av biologiske stimuli (f.eks vekstfaktorer, inhibitorer, eller små molekyler) eller matrise struktur (f.eks sammensetning, konsentrasjon, eller stivhet av matrisen) varierer over plass, ville muliggjøre et bredt spekter av undersøkelser om hvordan disse variablene påvirker celledifferensiering, migrasjon og andre fenomener. Den store utfordringen i å skape lag matriser er å opprettholde den strukturelle integriteten lag grensesnitt uten diffusjon av enkeltkomponenter fra hvert lag en. Aktuelle metoder for å oppnå dette er photopatterning 2-3, litografi 4, sekvensiell functionalization5, frysetørking 6, MicroFluidics 7 eller 8 sentrifugering, mange av dem krever avansert instrumentering og tekniske ferdigheter. Andre er avhengige sekvensiell feste individuelle lag, som kan føre til delaminering av lagene 9 </sup>.
DGMP overvinner disse problemene ved hjelp av en inert tetthet modifier eksempel iodixanol å lage lag av varierende densiteter 10. Siden tettheten modifier kan blandes med noe prepolymer eller bioaktive molekyler, lar DGMP hver stillas lag som skal tilpasses. Simpelthen variere konsentrasjonen av tettheten modifier hindrer blanding av tilgrensende lag mens de forblir vandig. Etterfølgende enkelt trinn polymerisasjon gir opphav til en strukturelt kontinuerlig flerlags stillas, hvor hvert lag har distinkte kjemiske og mekaniske egenskaper. Tettheten modifier kan enkelt fjernes med tilstrekkelig skylling uten forstyrrelse av de enkelte lag eller deres komponenter. Denne teknikken er derfor velegnet for å lage hydrogeler i forskjellige størrelser, former og materialer.
En protokoll for fremstilling av en 2D-polyetylenglykol (PEG) gel, hvori vekslende lag innlemme RGDS-350, er angitt nedenfor. Vi bruker PEG because det er biokompatibelt og inert. RGDS, en celleadhesjon 11 peptid, blir brukt til å demonstrere romlig begrensning av en biologisk cue og konjugering av en fluorofor (Alexa Fluor 350) gjør det mulig å visuelt skille ulike lag. Denne prosedyren kan tilpasses for andre materialer (f.eks kollagen, hyaluronan, etc.) og kan utvides til å fabrikkere 3D geler med noen modifikasjoner 10.
DGMP er en enkel strategi for å forberede flerlags geleer som ikke er avhengig av dyre instrumentering. Denne protokollen kan tilpasses for å skape stillaser bruker andre biokompatible materialer, slik som kollagen og hyaluronsyre. Bioaktive små molekyler, for eksempel celle adhesjon-fremme RGDS peptid, kan tjoret til polymermatriksen for å unngå sammenblanding av signaler mellom lag. Proteiner kan innkapsles i distinkte lag uten behov for kjemisk konjugering som de, avhengig matrisen maskevidde, er mindre tilbøyelige til å diffundere gjennom hydrogeler 10. Her har vi brukt iodixanol (Nycoprep), en inert tetthet modifier, som tidligere har vært brukt for levedyktige celle applikasjoner. Andre tetthet bestemmelsesord slik som sukrose og dekstrose kan også brukes. Ved å variere innsovningstid (t s), kan man finjustere grensesnittene mellom to lag for å produsere jevne eller skarpe overganger etter behov (lengre innsovningstid gir jevnere overganger) <sup> 10. For eksempel, kunne jevnere overganger mellom DGMP gel lag brukes til å generere en kontinuerlig gradient av en biologisk stikkordet å studere celleprosesser som kjemotaksis.
Effekten av tetthet modifier på gel stivhet er vist i figur 5 for en 15% aPEGda gel; en mer komplett karakterisering av stivhet og porøsitet som en funksjon av PEGda og iodixanol konsentrasjoner blir nå vurdert. Mens PEGda konsentrasjonen i dette eksempelet er relativt høy, observerte vi en 60% høyere elastisitetsmodul i geler med 30% sammenlignet med iodixanol geler uten. Endringen i gel stivhet kan justeres for ved å modulere makromer konsentrasjon eller tverrbinding tetthet.
Vi har også brukt DGMP teknikk for å lage 3D flerlags gels med polyakrylamid og PEG forløpere 10. Variere konsentrasjonen eller graden av tverrbinding av prepolymeren tillater strukturelle variasjon istillas, som kan brukes til å utforske celle atferd som polarisert vekst og migrasjon i 3D.
Oppsummert er DGMP en tilpasningsdyktig teknikk som kan brukes til å dikte 2D og 3D stillasene fra en rekke biokompatible materialer for et bredt spekter av biomedisinske og grunnleggende forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlige for støtten fra NIH regissørens nye Innovator Awards (1DP2 OD006499-01 til AA og 1DP2 OD006460-01 til Aje), og kong Abdulaziz City for Science and Technology (UC San Diego Center of Excellence i nanomedisin). Vi vil gjerne takke Ms Jessica Moore for hennes kritiske kommentarer til manuskriptet.
Reagent or Instrument | Company | Catalogue number |
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM) | Laysan | 120-64 |
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda) | Dajac Labs | 9359 |
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS) | American Peptide | 49-01-4 |
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA) | Sigma | D125806 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2438 |
N,N- dimethylformamide (DMF) | Fisher | D119-4 |
Tetrahydrofuran (THF) | Fisher | T397 |
Dialysis cassette (3500 Da) | Thermo Scientific | 66330 |
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester | Life Technologies | A-10168 |
Sigmacote | Sigma | SL2 |
Silicone spacers | Grainger | 1MWA4 |
Biopsy punches | Acuderm | P1025 (10 mm) P850 (8 mm) |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Hyclone | SH30028 |
Iodixanol (NycoPrep) | Fisher | NC9388846 |
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Life Technologies | 11054 |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082 |
Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140 |
C2C12 myoblasts | ATCC | CRL-1772 |
MALDI | Bruker | N/A |
UVR-9000 | Bayco | UVR-9000 |
VersaDoc | Bio-Rad | N/A |