घनत्व ढाल multilayered polymerization (DGMP): मल्टी डिब्बे बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक, ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अनुकूलन scaffolds

Summary

यहाँ हम ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अलग परतों के बीच निरंतर इंटरफेस के साथ biocompatible, स्तरित matrices बनाने के लिए एक अद्वितीय रणनीति का वर्णन. इस तरह के एक पाड़ एक आदर्श अनुकूलन वातावरण प्रदान करने के लिए विभिन्न जैविक, रासायनिक या यांत्रिक संकेत सेल व्यवहार ठीक कर सकता है

Abstract

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer¹. Current methodologies to achieve this include photopatterning^2-3, lithography⁴, sequential functionalization5, freeze drying⁶, microfluidics⁷, or centrifugation⁸, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers⁹.

DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities¹⁰. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.

A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide¹¹, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications¹⁰.

Protocol

1. Fluorescently लेबल Acryloyl खूंटी Rgds संश्लेषण कमरे के तापमान पर और एनएन (DIPEA) diisopropylethylamine argon तहत डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 1.2:1:2 दाढ़ अनुपात में: acryloyl खूंटी succinimidyl Carboxymethyl एस्टर (3400 छ / mol aPEG SCM, खूंटी मेगावाट) के साथ Rgds पेप्टाइड अभिक्रिया रातोंरात. उड़ान के मैट्रिक्स की मदद से लेजर / desorption ionization समय (MALDI-TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री विकार की पुष्टि करें. APEG Rgds प्रतिक्रिया MALDI लक्ष्य और शुष्क पर एक नमूना हाजिर करने के लिए समाधान के 1 μl जोड़ें. यूनिवर्सल MALDI मैट्रिक्स tetrahydrofuran (THF) और 1 मिनट के लिए भंवर के संतृप्त घोल तैयार करें. एक ही नमूना हाजिर करने के लिए इस समाधान का ~ 1 μl जोड़ें. तुलना लिए aPEG-SCM के लिए प्रक्रिया को दोहराएँ. लोड और विश्लेषण. Rgds aPEG – आणविक वजन aPEG SCM (2 चित्रा) से अधिक होना चाहिए. Fluorophore संयुग्म, Alexa Fluor 350 कार्बोक्जिलिक एसिड (succinimydyl एस्टर) के एक equimolar राशि, भंग जोड़नेDMSO की एक न्यूनतम मात्रा में, aPEG – rgds 1.1 से प्रतिक्रिया समाधान के लिए और कमरे के तापमान पर argon तहत रातोंरात प्रतिक्रिया. डि एच 2 ओ के खिलाफ (मेगावाट दा 3500) 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,000:1 बड़ा अनुपात में 48 घंटे के लिए dialyzing, dialysate प्रति दिन कम से कम दो बार का आदान प्रदान द्वारा aPEG – rgds-350 शुद्ध. रुक शुद्ध Labconco Freezone प्लस या समकक्ष फ्रीज सूखे प्रणाली में aPEG rgds-350 और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान सूखी 2. एक 2d और एक 2d खूंटी जेल की मोल्ड निर्माण के rgds-350 परतों बारी के साथ तैयार Hydrophobic गिलास स्लाइड तैयार. एक वैक्यूम ओवन में एक कांच की डिश में स्वच्छ कांच स्लाइड रखें. 80 करने के लिए गर्मी ° C 30 मिनट के लिए पूरी तरह से सूखी सतहों. एक धूआं हुड में स्लाइड के साथ प्लेस पकवान और प्रत्येक स्लाइड के 250 μl Sigmacote जोड़ने, धीरे कोट पूरी सतह के लिए 30 सेकंड के लिए कमाल. अच्छी तरह से 100% मेथनॉल के साथ लेपित स्लाइड कुल्ला, आसुत पानी में धोने, एल ई ऐज़ में 5 मिनट के लिए दो बार में भिगोने के द्वारा पीछा कियाटी 10 मिलीलीटर. 10 मिमी बायोप्सी घूंसे के साथ सिलिकॉन spacers (0.8 मिमी मोटी) काटें. सिलिकॉन spacers और Sigmacote का इलाज गिलास स्लाइड आटोक्लेव. मिश्रण खूंटी diacrylate (PEGda) द्वारा व्यक्तिगत microfuge ट्यूब में प्रत्येक संबंधित परत के लिए समाधान तैयार अग्रदूत (अंतिम एकाग्रता 15% w / v) अलग अलग मात्रा में (60% पानी में स्टॉक समाधान) iodixanol की बदलती अंतिम सांद्रता (उदाहरण के लिए 40% की उपज के साथ, 30%, 20% और 10%), फॉस्फेट के साथ शेष मात्रा का सप्लीमेंट खारा (पीबीएस) buffered वर्गीकृत घनत्व का समाधान प्राप्त करने के लिए. एक समान तरीके में, परतों बारी के लिए, iodixanol और पीबीएस के साथ मिश्रण aPEG – rgds 350 (अंतिम एकाग्रता 8 मिमी) विभिन्न सांद्रता (उदाहरण के लिए 35%, 25% और 15%) उपज. Photoinitiator विभिन्न परतों (प्रत्येक परत समाधान के प्रति मिलीलीटर शेयर समाधान के 10 μl) के लिए प्रत्येक समाधान के लिए (2-hydroxy-4'-(2 hydroxyethoxy) 2 – methylpropiophenone, N-vinyl pyrrolidone में 333mg/ml स्टॉक) जोड़ें. मैं Photoinitiatorएस पिछले कहा मोल्ड में जैल के layering से पहले polymerization रोकने के लिए, के रूप में यह प्रकाश के प्रति संवेदनशील है. इस प्रोटोकॉल के बाद के कदम एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाएगा सुनिश्चित करने के लिए बाँझपन. प्रत्येक समाधान का उपयोग कर एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज और 0.2 फिल्टर सुक्ष्ममापी फिल्टर बाँझ. दो Sigmacore इलाज गिलास स्लाइड और रखने के रूप में चित्र 1 में दर्शाया clamps के साथ सुरक्षित के बीच स्पेसर sandwiching द्वारा मोल्ड स्थापना इकट्ठे. सबसे घने समाधान (40% iodixanol साथ जैसे PEGda) 1, एक कम घने समाधान (उदाहरण के लिए 35% iodixanol साथ aPEG – rgds-350) के द्वारा पीछा जोड़कर स्तरित जैल कास्ट. वैकल्पिक layering दोहराएँ वांछित संरचना और घनत्व की कई परतों को प्राप्त करने के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है. 3 मिनट के लिए 365 एनएम प्रकाश के साथ मोल्ड एक पोर्टेबल UVR 9000 दीपक का उपयोग चमकाना. Polymerized जैल 5 मिनट के लिए इलाज करने की अनुमति दें. Clamps निकालें, तो धीरे से ऊपर गिलास उठास्लाइड और मोल्ड, स्तरीकृत DGMP जैल स्लाइड्स पर रहेगा. एक बाँझ रंग का उपयोग करना है, ध्यान से एक 50 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस या धोने के लिए संस्कृति के माध्यम युक्त ट्यूब में जैल जगह है. 1,000:1 बड़ा अनुपात में धो पीबीएस में polymerized जैल, बफर प्रति दिन कम से कम दो बार घनत्व आपरिवर्तक, photoinitiator, और unreacted बहुलक हटाने का आदान प्रदान. वैकल्पिक रूप से, पीबीएस सेल के विकास के माध्यम से विमर्श किया जा सकता है. पीबीएस या सेल संस्कृति चरण 3 में उल्लिखित प्रयोग के लिए मध्यम विकास में DGMP जैल स्टोर. बारी परतों कल्पना, नमूना ट्रे पर एक VersaDoc जेल प्रलेखन इकाई के एक शासक के साथ DGMP जेल (इन जैल सेल संस्कृति के लिए उपयोगी नहीं होगा) की व्यवस्था है. 350 एनएम में जैल बेनकाब, जोखिम समय की fluorophore एकाग्रता पर निर्भर करते हुए भिन्न हो जाएगा. DGMP hydrogel में काले और नीले रंग के बैंड का बारी – बारी से अलग रासायनिक संरचना (3 चित्रा) की असतत परतों के गठन को प्रदर्शित करता है. <p class="Jove_title"> 3. DGMP जैल पर 2 डी सेल संस्कृति Rgds पेप्टाइड शामिल जैल, आसंजन निर्भर कोशिकाओं, ऐसे C2C12 myoblasts के रूप में उपयोग करें. धीरे 48 अच्छी तरह से सेल संस्कृति एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में एक बाँझ सेल खुरचनी का उपयोग प्लेटों के कुओं में DGMP जैल (पीबीएस में संग्रहीत) सम्मिलित हैं. पूर्व गर्म वृद्धि मध्यम (है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम या DMEM 10% v / v भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% v / v 100x पेनिसिलिन – स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के साथ पूरक) और 37 पर एक पानी स्नान सेट में पीबीएस ° सी. पीबीएस के साथ C2C12 तीन बार कोशिकाओं के एक 60% संगामी प्लेट (10 मिमी) धो लें. 0.25% ट्रिप्सिन-EDTA के 1 मिलीलीटर जोड़ने और 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा PBS और फसल कोशिकाओं Aspirate. मध्यम विकास और गिनती कोशिकाओं में कोशिकाओं Resuspend. बीज DGMP जेल युक्त सेल संस्कृति C2C12 myoblasts (20,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) के साथ अच्छी तरह से. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2/95% सापेक्ष आर्द्रता में कोशिकाओं सेते हैं. धीरे से 4 घंटे के बाद विनिमय मध्यम, सावधान करने के लिए नहीं कर रहे हैंहल्के ढंग से पालन कोशिकाओं चाल. 24 घंटे के बाद, DGMP जैल का Rgds युक्त परतों पर C2C12 myoblasts की कुर्की epifluorescence और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी (Zeiss 200 Axiovert) द्वारा की पुष्टि की जा सकती है.

Representative Results

MALDI-TOF विश्लेषण Rgds acryloyl खूंटी पेप्टाइड (2 चित्रा) के विकार की पुष्टि करता है. जेल इमेजिंग photopolymerization (चित्रा 3 ए) के बाद इस rgds-350 परतों (नीला) से पता चलता है. के रूप में चित्र 3A में दिखाया गया है, 2 डी DGMP जेल आकार सिलिकॉन molds के व्यास (10 मिमी, छोड़ दिया; 8 मिमी, सही) के आधार पर अलग किया जा सकता है, और इसलिए कई assays में उपयोग करने के लिए आसानी से अनुकूलन कर रहे हैं – इस मामले में एक फिट 48 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट (3B चित्रा). Epifluorescence और एक DGMP जेल पर सभ्य C2C12 myoblasts के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी पर चयनात्मक लगाव से पता चलता है rgds-350-खूंटी (4 चित्रा) युक्त परतों, कोशिका आसंजन पेप्टाइड (Rgds) की compartmentalization प्रदर्शन. चित्रा 1. आण्विक weight MALDI-TOF में Rgds पेप्टाइड के विकार के बाद प्राप्त aPEG Rgds aPEG-SCM तुलना द्वारा विश्लेषण. चित्रा 2. DGMP जेल निर्माण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व बाद ढ़ाल स्तरित हैं, वे समय की अवधि (एस एंड टी) को अलग करने के लिए स्नातक की उपाधि प्राप्त इंटरफेस, photopolymerization द्वारा पीछा बनाने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दी जा सकती है. स्तरीकृत DGMP जैल आसानी से आगे उपयोग के लिए सांचे से निकाला जा सकता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 3) 2d multilayered photopolymerization बाद प्राप्त जैल 350 एनएम और प्रतिकूल की सफेद प्रकाश चैनलों का उपयोग imagedडॉक्टर जेल प्रलेखन इकाई. ग्रेस्केल छवि). बी 48-अच्छी तरह से सेल संस्कृति बर्तन में सफेद में rgds युक्त DGMP जेल की निवेशन परतों बारी से पता चलता है. चित्रा 4 विलय चरण विपरीत और C2C12 DGMP जैल (पैमाने बार 50 सुक्ष्ममापी) पर हो myoblasts epifluorescence छवि. चित्रा 5. Iodixanol जेल सतह लोच पर प्रभाव. Crosslinked खूंटी substrates एक 2 nn बल 12 ट्रिगर के साथ पहले से स्थापित तरीकों का उपयोग कर के स्थिर नमूनों की परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी माप. * <0.05 पी और ** 0.01 <पी.

Discussion

DGMP multilayered जैल है कि महंगे उपकरण पर भरोसा नहीं करता है के लिए तैयारी करने के लिए एक सरल रणनीति है. इस प्रोटोकॉल कोलाजेन और hyaluronic एसिड के रूप में अन्य biocompatible सामग्री का उपयोग scaffolds बनाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. Bioactive छोटे अणुओं, उदाहरण के लिए कोशिका आसंजन Rgds पेप्टाइड बढ़ावा देने, बहुलक मैट्रिक्स को सीमित किया जा सकता है परतों के बीच संकेत के मिश्रण को रोकने के. प्रोटीन रासायनिक विकार के लिए आवश्यकता के बिना अलग परतों में समझाया जा सकता क्योंकि वे, मैट्रिक्स जाल आकार पर निर्भर करता है, कम करने के लिए ¹⁰ hydrogels के माध्यम से फैलाना प्रवण हैं. यहाँ हम (Nycoprep) iodixanol, एक आभ्यांतरिक घनत्व आपरिवर्तक है, जो पहले व्यवहार्य सेल अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है. Sucrose और dextrose रूप में अन्य घनत्व संशोधक भी इस्तेमाल किया जा सकता है. व्यवस्थित समय (टी _एस) द्वारा अलग, एक दो परतों के बीच इंटरफेस चिकनी या तेज बदलाव के रूप में की जरूरत है (लंबे समय तक व्यवस्थित समय निर्बाध संक्रमण देता है) ठीक धुन कर सकते हैं <> 10 समर्थन. उदाहरण के लिए, DGMP जेल परतों के बीच चिकनी संक्रमण chemotaxis के रूप में सेल प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक जैविक क्यू के एक सतत ढाल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जेल कठोरता पर घनत्व आपरिवर्तक का प्रभाव एक 15% aPEGda जेल के लिए चित्रा 5 में दिखाया गया है, और PEGda और iodixanol सांद्रता के एक समारोह के रूप में कठोरता और porosity के एक अधिक संपूर्ण लक्षण वर्णन वर्तमान में मूल्यांकन किया जा रहा है. जबकि इस उदाहरण में PEGda एकाग्रता अपेक्षाकृत अधिक है, हम 30% iodixanol के साथ जैल में बिना जैल की तुलना में 60% अधिक लोचदार मापांक मनाया. modulating macromer एकाग्रता या crosslinking घनत्व के द्वारा जेल कठोरता में परिवर्तन के लिए समायोजित किया जा सकता है.

हम भी DGMP के लिए 3 डी multilayered polyacrylamide और खूंटी ¹⁰ व्यापारियों का उपयोग जैल बनाने के लिए तकनीक का आवेदन किया है. एकाग्रता या prepolymer की crosslinking की डिग्री परिवर्तनीय में संरचनात्मक बदलाव की अनुमति देता हैscaffolds, जो सेल polarized और 3 डी में विकास प्रवास के रूप में इस तरह के व्यवहार का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

सारांश में, DGMP एक अनुकूलनीय तकनीक है कि बायोमेडिकल और बुनियादी अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए एक व्यापक रेंज biocompatible सामग्री की एक किस्म से 2 डी और 3 डी scaffolds निर्माण करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Materials

Reagent or Instrument	Company	Catalogue number
Polyethylene glycol succinimydyl carboxymethyl (a-PEG-SCM)	Laysan	120-64
Polyethelyene glycol diacrylate (PEGda)	Dajac Labs	9359
Arginine-Glycine-Aspartic acid-Serine (RGDS)	American Peptide	49-01-4
N,N– Diisopropylethylamine (DIPEA)	Sigma	D125806
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2438
N,N- dimethylformamide (DMF)	Fisher	D119-4
Tetrahydrofuran (THF)	Fisher	T397
Dialysis cassette (3500 Da)	Thermo Scientific	66330
Alexa Fluor 350 carboxylic acid succinimydyl ester	Life Technologies	A-10168
Sigmacote	Sigma	SL2
Silicone spacers	Grainger	1MWA4
Biopsy punches	Acuderm	P1025 (10 mm) P850 (8 mm)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)	Hyclone	SH30028
Iodixanol (NycoPrep)	Fisher	NC9388846
2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone	Sigma	410896
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Life Technologies	11054
Fetal bovine serum	Life Technologies	10082
Penicillin-streptomycin	Life Technologies	15140
C2C12 myoblasts	ATCC	CRL-1772
MALDI	Bruker	N/A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	Bio-Rad	N/A