Höger systolisk tryckmätningar i kombination med Skörd av lung-och Immune vävnadsprover i möss
Summary
En specifik och snabb protokoll att samtidigt undersöka höger hjärtfunktion, lunginflammation och immunsvaret beskrivs som ett verktyg för lärande. Video och siffror beskriver fysiologi och teknik mikrodissektion i en organiserad grupp-strategi som kan anpassas för att användas för små till stora studier.
Abstract
Funktionen av den högra hjärtat att pumpa blod genom lungorna, vilket förbinder högerhjärtat fysiologi och pulmonell vaskulär fysiologi. Inflammation är en vanlig modifierare av hjärta och lungfunktion, genom att utarbeta cellulär infiltration, produktion av cytokiner och tillväxtfaktorer, och genom att initiera ombyggnad processer 1.
Jämfört med vänster kammare, är den högra ventrikeln en lågtryckspump som verkar i en relativt smal zon av tryckförändringar. Ökade lungartären tryck är förknippade med ökat tryck i lungan kärlbädden och pulmonell hypertension 2. Pulmonell hypertoni är ofta förknippad med inflammatoriska lungsjukdomar, exempelvis kronisk obstruktiv lungsjukdom, eller autoimmuna sjukdomar 3. Eftersom pulmonell hypertension ger en dålig prognos för livskvalitet och livslängd är mycket forskning inriktad mot att förstå de mekanismer som MIGht vara mål för läkemedel ingripande 4. Den största utmaningen för utvecklingen av effektiva verktyg för pulmonell hypertension är komplexiteten i den samtidiga förståelse av molekylära och cellulära förändringar i den högra hjärtat, lungorna och immunsystemet.
Här presenterar vi en processuell arbetsflöde för snabb och exakt mätning av tryckförändringar i rätt hjärta möss och samtidigt skörden av prover från hjärta, lungor och immunförsvar vävnader. Metoden är baserad på direkta kateterisering av höger kammare via jugularvenen i nära överkropp möss, först utvecklades i slutet av 1990-talet som surrogat mått tryck i lungartären 5-13. Den organiserade team-strategi underlättar en mycket snabb rätt teknik hjärtkateterisering. Detta gör det möjligt att utföra mätningar i möss som spontant andas rumsluft. Organisationen av arbetet flöde i olika arbets-områdenminskar tidsfördröjning och öppnar möjligheten att samtidigt utföra fysiologiska experiment och skörd immun, hjärt-och lung vävnader.
Den processuella arbetsflöde beskrivs här kan anpassas för en mängd olika laboratoriemiljö och mönster studie, från små, riktade experiment till stora analyser av läkemedel. Den samtidiga förvärv av hjärt fysiologi data som kan utvidgas till att omfatta ekokardiografi 5,14-17 och skörd av hjärta, lungor och immunförsvar vävnad minskar antalet djur som behövs för att få fram data som rör den vetenskapliga kunskapsbas framåt. Den formella arbetsflödet presenteras här ger också en idealisk bas för att få kunskap om de nätverk som sammanbinder immun-, lung-och hjärtfunktion. Samma principer som beskrivs här kan anpassas för att studera andra eller ytterligare organ som behövs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den experimentella flöde beskrivs här möjliggör snabb och samtidig mätning av höger kammare systoliskt blodtryck samt skörd av prover för analys av svaren i lungorna, hjärtat och immunförsvaret hos möss. Förfarandet kombinerar mätningar hjärta fysiologi, mikro-dissekering och senare vävnad skörd för levande celler studier, histologisk analys eller genomik-analys av vävnader. Hela förfarandet tar mindre än 20 minuter per mus. På grund av arbets-området organiserade arbetsflöde kan 2-3 djur studeras…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG), R01HL082694 (JW), American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG), Stony Wold – Herbert Fund, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments |
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
