Method Article

تطبيق أدوية المحلية لدراسة وظيفة مستقبلات أستيل النيكوتينيك في شرائح مخ الفأر

DOI:

10.3791/50034

⸱

October 29th, 2012

 ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة مفيدة لدراسة يجند القناة الايونية بوابات وظيفة الخلايا العصبية في الدماغ من شرائح معزولة تماما. هذا الأسلوب ينطوي على استخدام المخدرات micropipette مليئة للاستخدام الموضعي من الأدوية إلى الخلايا العصبية باستخدام معيار تقنيات سجلت المشبك التصحيح.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعاطي التبغ يؤدي إلى مشاكل صحية عديدة، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب وانتفاخ الرئة، والسكتة الدماغية. الإدمان على تدخين السجائر هو اضطراب السائد العصبية والنفسية التي تنبع من الإجراءات الفيزيائية الحيوية والخلوية من النيكوتين على مستقبلات النيكوتين أستيل (nAChRs) في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي. فهم أنواع فرعية مختلفة nAChR التي توجد في مناطق الدماغ ذات الصلة لإدمان النيكوتين هو أولوية رئيسية.

التجارب التي تستخدم تقنيات الكهربية مثل المشبك التصحيح خلية كاملة أو ثنائية القطب التسجيلات المشبك الجهد مفيدة لتوصيف الدوائية للnAChRs المصالح. يتم عزل الخلايا جسديا nAChRs التعبير عن مثل الثدييات خلايا البويضات أو زراعة الأنسجة القيطم المورق، وبالتالي فهي تدرس بسهولة باستخدام أدوات علم الأدوية الحديثة. وقد أحرز تقدم كبير باستخدام هذه التقنيات، وخاصة عندما كان معروفا بالفعل لمستقبلات الهدفوقد تحقق بسهولة الثانية خارج الرحم التعبير. في كثير من الأحيان، ومع ذلك، فمن الضروري دراسة nAChRs في بيئتها الأصلية: في الخلايا العصبية داخل الدماغ شرائح تحصد تماما من الفئران المختبرية أو الفئران. على سبيل المثال، الفئران معربا عن "الحساسية" مفارز nAChR مثل الفئران L9'A α4 1 و الفئران α6 L9'S 2، تسمح لتحديد لا لبس فيها من الخلايا العصبية على أساس التعبير الوظيفية من حدة فرعية nAChR محددة. على الرغم من القيام به بشكل روتيني خلية كاملة التسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الدماغ من قبل شرائح الكهربية المهرة، فإنه يمثل تحديا لتطبيق محليا المخدرات مثل النيكوتين أستيل أو إلى داخل الخلية سجلت شريحة الدماغ. التخفيف من المخدرات إلى superfusate (تطبيق حمام) لا يمكن عكسها بسرعة، ولا U-أنبوب نظم تتكيف بسهولة للعمل مع شرائح الدماغ.

في هذه الورقة، ونحن تصف طريقة لتطبيق بسرعة nAChR-تفعيل المخدرات إلى الخلايا العصبية المسجلة في م الكبار[أوس] شرائح الدماغ. يتم إجراء القياسية خلية كاملة من الخلايا العصبية في التسجيلات شرائح، وناور لmicropipette الثانية المملوءة دواء من الاهتمام إلى موقف بالقرب من الخلية المسجلة. حقنة من الهواء المضغوط أو النيتروجين خامل في ماصة المخدرات مليئة يسبب كمية صغيرة من المخدرات حل يمكن إخراجه من ماصة على الخلية المسجلة. باستخدام هذا الأسلوب، nAChR بوساطة تيارات قادرة على أن تحل بدقة ميلي ثانية واحدة. يمكنك بسهولة تطبيق مرات المخدرات أن تختلف، ويمكن سحب ماصة المخدرات مليئة واستبدالها ماصة جديدة، والسماح لأن يتم إنشاء منحنيات التركيز والاستجابة لالخلايا العصبية واحدة. على الرغم من وصفها في سياق بيولوجيا الأعصاب nAChR، ينبغي أن تكون مفيدة هذه التقنية لدراسة أنواع عديدة من القنوات الأيونية يجند بوابات أو المستقبلات في الخلايا العصبية من الدماغ شرائح.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول لإعداد شريحة الدماغ والكهربية

  1. وقد وصفت سابقا الحلول لإعداد شرائح الدماغ 3 و 4. إعداد N-D-glucamine الميثيل (NMDG) على أساس القطع والانتعاش الحل للتكوين التالية (مم): 93 ن ميثيل D-glucamine، 2.5 بوكل، 1.2 ناه 2 PO 4 و 30 NaHCO 3 و 20 HEPES، 25 الجلوكوز، 5 أسكوربات + نا (2)، ثيوريا، 3 البيروفات + نا، 10 MgSO 4 • 7H 2 O، 0.5 CaCl 2 • 2H 2 O. التكيف مع 300-310 الميلي أسمول مع NMDG. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7،3-7،4 مع حم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تجاربنا، ونحن بشكل روتيني من تسجيل الدوبامين (DA) الخلايا العصبية المنتجة للفي المنطقة الجوفية السقيفية (VTA) والمادة السوداء الجزء المكتنزة (SNC). في الجهد المشبك واسطة، وتطبيق ضغط أستيل النيكوتين أو لهذه الخلايا يؤدي عادة في السريع، الموجبة الحالية التي تصل إلى ذروتها الداخل 100-200 ميللي ثانية في (الشكل 1A-B). وأملت إلى حد كبير من تسوس الحالي بنسبة انتشار المخدرات من موقع العمل، وعما إذا كانت الإنزيمات في شريحة موجودة على استقلاب الدواء في شكل غير نشط. على س.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأسلوب الواردة في هذه الوثيقة على نطاق واسع هو مفيد لدراسة يجند القناة الايونية بوابات ظيفة في الأعمال التحضيرية شريحة الدماغ. ومع ذلك، هناك عدد من العوامل التي من شأنها أن تؤثر تأثيرا كبيرا على نوعية واستنساخ البيانات التجريبية التي تنتج عن استخدام هذه الطريقة. على سبيل المثال، أثار التيارات هي حساسة جدا لقطر غيض من ماصة المخدرات شغلها. نصائح صغيرة سوف يسبب صعوبة إخراج الحل مع المخدرات، ونصائح كبيرة مع انخفاض المقاومة سوف تكون أكثر عرضة لتعطيل ختم gigaohm بين الخلية ومسجل القطب .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة DA030396. بفضل أعضاء المختبر Drenan للمناقشة ونقد مفيدة للمخطوطة. ران مي شكر خاص لكيم للمساعدة التقنية وجوناثان تينغ توماس للمشورة بشأن الكبار شرائح مخ الفأر.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

اسم كاشف شركة كتالوج عدد

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
N-ميثيل D-glucamine سيجما M2004
بوكل سيجما P3911
ناه 2 PO 4 سيجما S9638
NaHCO 3 سيجما S6014
HEPES سيجما H3375
الجلوكوز سيجما G5767
نا + أسكوربات سيجما A4034
ثيوريا سيجما T8656
نا + البيروفات سيجما P2256
MgSO 4 • 7H 2 O سيجما 230391
CaCl 2 • 2H 2 0 سيجما 223506
كلوريد الصوديوم سيجما S9625
نا + نوادي المضاربة والإستثمار الصيدلة 76351315
غلوكونات البوتاسيوم سيجما G4500
EGTA سيجما E3889
المغنيسيوم-ATP سيجما A9187
GTP سيجما G8877
DSK-ZERO 1 بالاهتزاز تقطيع اللحم تيد بيلا، شركة
P-97 المشتعلة / براون micropipette مجتذب سوتر
غرفة RC-27 تسجيل وارنر
سخان TC-344B الإرواء تحكم وارنر 640101
SH-27B الحل سخان وارنر 640102
نيكون FN-1 نيكون
فيديو CCD C-7500 كاميرا هاماماتسو
Picospritzer III عام شركة صمام
MP-285 مياداة مجهرية سوتر
PA-100 مترجم كهرضغطية piezosystem جينا، وشركة
12V40 بيزو مكبر للصوت piezosystem جينا، وشركة
Axopatch 200B الجزيئي الأجهزة كورب
Digidata 1440A الجزيئي الأجهزة كورب

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tapper, A. R. Nicotine activation of ?4* receptors: sufficient for reward, tolerance, and sensitization. Science. 306, 1029-1032 (2004).
  2. Drenan, R. M. In vivo activation of midbrain dopamine neurons via sensi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nicotinic Acetylcholine ReceptorBrain Slice PreparationWhole Cell Patch ClampLocal Drug ApplicationPressure Ejection SystemMicromanipulator TechniqueVoltage Clamp RecordingDopamine Neuron AnalysisAlpha6 L9 S MousePizo Electric Translator

Related Articles